Bakterie mléčného kvašení (bmk) jsou heterogenní skupinou mikroorganismů, které mohou fermentovat různé živiny za vzniku mléčné kyseliny

Metody

1. Kultivace bakteriálních buněk

1. 
   Jednotlivé kmeny bakterií druhu Lactobacillus paracasei, narostlé na MRS agaru, byly naočkovány do 10 ml tekutého MRS média a aerobně kultivovány v termostatu
   při 37 °C.
   
2. 
   Narostlá bakteriální kultura byla přeočkována křížovým roztěrem na Petriho misky s MRS agarem. Kultivace probíhala aerobně při 37 °C.
   
3. 
   Byl zkontrolován vzhled kolonií a misky byly dále uchovávány v lednici.
   

2. Barvení preparátů podle Grama, mikroskopie

1. 
   Z bakteriální kultury narostlé přes noc bylo naneseno na sklíčko asi 10 μl a byl vytvořen fixovaný preparát (protažení sklíčka v plameni kahanu).
   
2. 
   Preparát byl ponořen do roztoku krystalové violeťi (30 s), poté bylo barvivo slito
   a preparát byl krátce opláchnut vodou.
   
3. 
   Dále byl preparát převrstven Lugolových roztokem (30 s), opláchnut vodou a poté odbarvován ethanolem (20 s).
   
4. 
   Po opláchnutí vodou byl preparát dobarven karbolfuchsinem (30–60 s), opět opláchnut vodou, usušen a pozorován pod olejovou imerzí (zvětšení 100).
   

Následující popsané metody byly prováděny (pokud není uvedeno jinak) dle návodů Španové a Ritticha: Učební texty laboratorních cvičení Speciální metody analýzy mikroorganismů I.; nepublikováno:

3. Izolace bakteriální DNA pomocí fenolové extrakce

1. Lyze buněk

1. 
   Bakteriální buňky rodu Lactobacillus, narostlé přes noc v MRS médiu, byly centrifugovány při 14 0000 ot/3min. Supernatant byl opatrně slit a sediment se nechal dobře odkapat.
   
2. 
   Sediment byl resuspendován v 1 ml roztoku 1 – nejdříve bylo přidáno 100l roztoku, potom zbývajících 900 l a suspenze byla dobře promíchána.
   
3. 
   Suspenze byla centrifugována při 14 000 ot/5 min. Supernatant byl opatrně slit
   a sediment se nechal dobře okapat. K sedimentu bylo přidáno 500 l roztoku 2
   a sediment byl důkladně rozsuspendován.
   
4. 
   Vzorky byly inkubovány při laboratorní teplotě po dobu 1 hodiny. Občas byly promíchány.
   
5. 
   K suspenzi bylo přidáno 12,5 l 20% SDS a 5 l proteinázy K (100 g/ml) a vše bylo promícháno.
   
6. 
   Vzorky byly inkubovány při 55 °C do druhého dne. Občas byly promíchány.
   
7. 
   Tyto hrubé lyzáty buněk byly použity pro gelovou elektroforézu a pro purifikaci DNA. V případně potřeby byly uchovány při -20 °C.
   

2. Fenolová extrakce

1. 
   Ke vzorkům bylo přidáno 10 l RNázy A (100 g/ml) a po promíchání byly vzorky inkubovány při 37 °C/30 min (degradace RNA).
   
2. 
   K lyzátům buněk byl přidán stejný objem roztoku 3 (předestilovaný fenol). Směs byla kývavým pohybem opatrně promíchávána 4 min a následně centrifugována
   při 14 000 ot/3 min.
   
3. 
   Pomocí špičky s ustřiženým hrotem byla odebrána horní vodní fáze s DNA do čisté eppendorfky. Bylo potřeba postupovat opatrně, aby nebyla odebrána proteinová mezivrstva.
   
4. 
   Byl opakován postup 2 a 3.
   
5. 
   K vodní fázi s DNA bylo přidáno 700 l CIZ a směs byla opatrně promíchávána kývavým pohybem 4 minuty.
   
6. 
   Směs byla centrifugována při 14 000 ot/3 min.
   
7. 
   Vodní fáze byla odebrána do čisté eppendorfky.
   
8. 
   Byl opakován postup 6 a 7.
   

3. Přesrážení DNA ethanolem

1. 
   Pomocí automatické pipety byl změřen objem vzorku DNA v eppendorfce.
   
2. 
   Ke vzorku DNA byla přidána 1/10 objemu 3 M octanu sodného a vzorek byl promíchán.
   
3. 
   Byl přidán 1 ml 96 % ethanolu a směs byla promíchána.
   
4. 
   DNA se nechala 1 h vysrážet při -20 °C.
   
5. 
   Směs byla 15 minut centrifugována při 14 000 otáčkách, při teplotě 4 °C. Supernatant byl opatrně slit a sediment se nechal dobře okapat.
   
6. 
   K sedimentu bylo přidáno 500 l 70 % ethanolu. Směs byla centrifugována při 14 000 ot/10 min při teplotě 4°C.
   
7. 
   Opatrně byl slit supernatant a sediment obsahující DNA byl usušen v exikátoru
   (15 min).
   
8. 
   DNA byla rozpuštěna v 500 l TE pufru a uskladněna při 4 °C.
   

Takto izolovaná DNA byla použita pro spektrofotometrické měření,

pro agarózovou gelovou elektroforézu a jako matrice pro rodově specifickou PCR.

4. Spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty DNA (pomocí spektrofotometru DMS-100S)

1. 
   Vzorek DNA rozpuštěné v TE pufru byl 10× zředěn TE pufrem a umístěn
   do křemenné spektrofotometrické kyvety (optická délka 1 cm). Do referenční kyvety byl nalit TE pufr. Obě kyvety se umístily do držáku spektrofotometru.
   
2. 
   Poté byla změřena absorbance v rozmezí vlnových délek 220–320 nm.
   
3. 
   Koncentrace DNA byla vypočtena z hodnoty absorbance naměřené při vlnové délce 260 nm podle vztahu: A₂₆₀ = 1 odpovídá koncentraci 50 g/ml (při použití kyvety s optickou dráhu 1 cm).
   

Jestliže byla DNA 10× ředěna, pak vztah na výpočet koncentrace je c = A₂₆₀ × 50 × 10 [g/ml].

4. 
   Čistota DNA byla stanovena z poměru hodnot absorbance A₂₆₀/A₂₈₀. Při vlnové délce 260 nm mají absorpční maximum nukleové kyseliny, při 280 nm bílkoviny. Leží-li hodnota poměru absorbancí A₂₆₀/A₂₈₀ mezi 1,8–2,0, lze DNA považovat za čistou. Přítomnost RNA ve vzorku se projevila vzrůstem poměru absorbancí nad hodnotu 2,0. Přítomnost bílkovin se projevila poklesem pod hodnotu 1,8.
   

5. Agarózová gelová elektroforéza

Agarózová gelová elektroforéza byla používaná k ověření přítomnosti, kvality

a ke stanovení přibližné koncentrace izolované bakteriální DNA a k detekci PCR produktů. Byly použity gely: 0,8% gel pro stanovení přítomnosti a kvality chromozomální DNA, 1,5% gel pro detekci PCR produktů o délce 250 bp.

1. Příprava agarózového gelu

1. 
   Příslušné množství agarózy bylo rozpuštěno v daném objemu 0,5 koncentrovaného TBE pufru. Suspenze byla důkladně rozvařena v mikrovlnné troubě.
   
2. 
   Roztok se nechal vychladnout na teplotu zhruba 60 °C a poté byl nalit
   do elektroforetické vaničky s hřebínkem, položené na vodorovné ploše.
   
3. 
   Gel se nechal přibližně 30 min tuhnout při laboratorní teplotě.
   
4. 
   Před nanášením vzorků na gel byl opatrně vyjmut hřebínek.
   

2. Nanášení vzorků na gel

1. 
   Před nanesením na gel byl vzorek připraven smícháním požadovaného množství DNA nebo PCR produktu se stop pufrem (6 koncentrovaným) v poměru 5 : 1. Vzorky byly nanášeny do komůrek na gelu ve směru zprava doleva.
   
2. 
   Gel byl umístěn do elektroforetické vany v takové orientaci, aby záporně nabitá DNA putovala k anodě. Gel byl opatrně převrstven 0,5 koncentrovaným TBE pufrem
   (do výšky 2–3 mm nad agarózový gel).
   
3. 
   Elektroforéza byla spuštěna zapnutím zdroje nastaveného na 80 V/1 hod nebo 60V/3 hod. Separace probíhala obvykle tak dlouho, dokud bromfenolová modř ze stop pufru nedomigrovala do 2/3 agarózového gelu.
   
4. 
   Po skončení elektroforézy byl gel barven v roztoku ethidiumbromidu (1 g/ml)
   0,5–1 hodinu.
   
5. 
   Obarvený gel byl opláchnut v destilované vodě a prohlížen na transilluminátoru v UV světle (305 nm). Pro dokumentaci byl gel vyfotografován digitálním fotoaparátem.
   

6. Rodově specifická PCR

Bakterie rodu Lactobacillus se detekují pomocí úseku DNA dlouhého 250 bp, který je amplifikovaný pomocí rodově specifických primerů LbLMA1-rev a R16-1 (popř. bio-R16-1) (Dubernet a kol. 2002):

• 
  LbLMA1-rev (rodově specifický primer) :
  

5´- CTC AAA ACT AAA CAA AGT TTC - 3´

• 
  R16-1 (univerzální primer):
  

5´- CTT GTA CAC ACC GCC CGT CA - 3´

PCR směs byla připravována v objemu 25 l dle následujícího schématu a poté byla DNA amplifikována v termocykleru podle programu LBC rod:

Komponenty PCR směsi (25 l): Program LBC rod:

Krok:	Teplota [ °C]	Čas:
1.	95	5 min
2.	95	30 s
3.	55	30 s
4.	72	1 min
5.	33 opakování kroku č. 2.–4.
6.	95	30 s
7.	55	30 s
8.	72	10 min
9.	4	-

PCR voda…………………………19 l

10 reakční pufr kompletní……… 2,5 l

dNTP (10mM)…………………… 0,5 l

primer LbLMA1-rev (10 pmol/l)..0,5 l

primer R16-1 (10 pmol/l)………. 0,5 l

Taq polymeráza 1.1 (1 U/l)……...1 l

DNA matrice……………………... 1 l

Po ukončení reakce byly vzorky uchovávány při teplotě -20 °C. Detekce PCR produktů byla prováděna pomocí agarózové gelové elektroforézy.

7. Izolace DNA z hrubých lyzátů  buněk Lactobacillus paracasei s využitím magnetických nosičů pokrytých COOH skupinami v prostředí 2,5 M NaCl a 8% PEG

Nejprve byly připraveny hrubé lyzáty buněk a z nich byla izolována DNA pomocí magnetických nosičů.

1. Příprava hrubých lyzátů buněk

Lyze buněk a příprava hrubých lyzátů byla prováděna postupem uvedeným v kapitole 3.5.3.1.

2. Magnetická separace

1. 
   V mikrozkumavkách byla připravena separační směs (v celkovém objemu 500 l) s magnetickými nosiči – byly testovány nosiče Fkol77ox. (2 mg/ml) a nosiče P(HEMA-co-GMA) (2 mg/ml), magnetické sklo sloužilo jako kontrola.
   

Jednotlivé komponenty separační směsi byly smíchávány v různých pořadích:

Komponenta:	Množství [l]:	Pořadí smíchávání jednotlivých komponent:
H2O	80	1.	1.	1.	1.
NaCl (5 M)	250	2.	2.	2.	2.
PEG 6000 (40 %)	100	3.	4.	4.	3.
Magnet. nosič	20	4.	3.	5.	5.
Hrubý lyzát	50	5.	5.	3.	4.
Celkový objem	500

2. 
   Směs byla řádně promíchaná a inkubována při laboratorní teplotě po dobu 15 min., během které došlo k navázání genomové DNA na nosič.
   
3. 
   Magnetické nosiče s již navázanou genomovou DNA byly odseparovány magnetickým separátorem (5 min.). Supernatant byl opatrně odpipetován a použit jako kontrola pro agarózovou gelovou elektroforézu.
   
4. 
   Magnetické nosiče byly promyty 70% ethanolem a opět odseparovány magnetickým separátorem (3 min.). Ethanol byl odpipetován.
   
5. 
   Byl opakován krok č. 4.
   
6. 
   Magnetické nosiče s navázanou DNA byly krátce usušeny v exikátoru.
   
7. 
   Po vysušení byla DNA eluována z magnetických nosičů do 50 l TE pufru po dobu 15 min. při laboratorní teplotě.
   
8. 
   Magnetické nosiče (již bez navázané DNA) byly odseparovány magnetickým separátorem a eluát obsahující DNA byl odpipetován do čisté eppendorfky.
   
9. 
   Takto vyizolovaná DNA byla použita pro agarózovou gelovou elektroforézu (20 l), pro spektrofotometrické měření a jako matrice pro rodově specifickou PCR.
   

8. Selektivní separace biotinylovaných PCR produktů pomocí magnetických nosičů s navázaným streptavidinem (dle Holmberga a kol. 2005)

1. Příprava biotinylovaných PCR produktů

Byla provedena rodově specifická PCR s primerem LbLMA1-rev a biotinylovaným primerem R16-1 (biotin přisyntetizován na 5´konci tohoto primeru). Pro amplifikaci a detekci amplikonů byly použity stejné podmínky jako u nebiotinylovaného primeru (viz. 3.5.6).

2. Přečištění biotinylovaných PCR produktů metodou reverzní imobilizace DNA na pevnou fázi

1. 
   K 90 l PCR produktu bylo přidáno 30 l magnetických částic P(HEMA-co-GMA) (2mg/ml), 60 l PEG (40%) a 120 l 5 M NaCl. Směs byla řádně promíchaná
   a inkubována při laboratorní teplotě po dobu 15 min.
   
2. 
   Magnetické částice s navázaným PCR produktem byly odseparovány magnetickým separátorem (5 min.). Supernatant byl opatrně odpipetován.
   
3. 
   Magnetické nosiče byly promyty 70% ethanolem a opět odseparovány magnetickým separátorem (3 min.). Ethanol byl odpipetován.
   
4. 
   Magnetické nosiče s navázaným PCR produktem byly krátce usušeny v exikátoru.
   
5. 
   Po vysušení byly PCR produkty eluovány z magnetických nosičů do 60 l TE pufru po dobu 15 min.
   
6. 
   Magnetické nosiče (použité pro uvolnění PCR produktů) byly odseparovány magnetickým separátorem a eluát obsahující PCR produkty byl odpipetován do čisté eppendorfky.
   
7. 
   Takto přečištěné biotinylované PCR produkty byly použity k separaci pomocí magnetických nosičů s navázaným streptavidinem.
   

3. Přečištění biotinylovaných PCR produktů pomocí fenolové extrakce

1. 
   K 200 l PCR produktu bylo přidáno 300 l TE pufru.
   
2. 
   K této směsi byl přidán stejný objem fenolu. Směs byla kývavým pohybem opatrně promíchávána 4 min a následně centrifugována při 14 000 ot/3 min.
   
3. 
   Dále se pokračovalo dle kapitoly 3.5.3.2 a 3.5.3.3.
   
4. 
   Nakonec byly biotinylované PCR produkty rozpuštěny v 100 l TE pufru a použity k separaci pomocí magnetických nosičů s navázaným streptavidinem.
   

4. Přečištění biotinylovaných PCR produktů pomocí PCR purifikačního kitu QIAquick

1. 
   K 100 μl PCR produktu bylo přidáno 500 μl PBI pufru (ke kterému byl před prvním použitím PCR kitu přidán 96% ethanol dle pokynů výrobce na štítku lahvičky); PBI pufr byl součástí purifikačního kitu a jeho složení nebylo uvedeno.
   
2. 
   Směs byla přenesena do kolonky, která byla umístěna do eppendorfky, a stočena
   30–60 sekund. Z eppendorfky byl odstraněn filtrát a kolonka byla znovu umístěna
   do eppendorfky.
   
3. 
   Do kolonky bylo přidáno 0,75 ml PE pufru (součást kitu, složení neuvedeno) a směs byla opět stočena 30–60 sekund. Z eppendorfky byl odstraněn filtrát, kolonka byla znovu umístěna do eppendorfky a stočena 1 minutu (důležité pro úplné odstranění ethanolu ze vzorku).
   
4. 
   Kolonka byla přenesena do čisté 1,5 ml eppendorfky. Do středu membrány v kolonce bylo přidáno 50 μl EB pufru (součást kitu, složení neuvedeno) nebo H₂O. Směs
   se nechala 1minutu inkubovat a poté byla stočena 1 minutu.
   
5. 
   Filtrát obsahující přečištěné biotinylované PCR produkty byl použit k separaci těchto PCR produktů pomocí magnetických nosičů s navázaným streptavidinem.
   

5. Izolace biotinylovaných PCR produktů pomocí magnetických nosičů s navázaným streptavidinem

Příprava magnetických nosičů PGMA-NH₂-STV:

1. 
   Ze zásobního roztoku (o neznáme koncentraci) byl odpipetován 1 ml magnetických nosičů resuspendovaných v 1 koncentrovaném PBS pufru.
   
2. 
   Přibližná koncentrace zásobního roztoku byla vypočtena rozdílem hmotností 1 ml zásobního roztoku magnetických nosičů resuspendovaných v 1 koncentrovaném PBS pufru a 1 ml 1 koncentrovaného PBS pufru.
   
3. 
   Magnetické nosiče byly 1, 2 a 4 zředěny 1 koncentrovaným PBS pufrem.
   

Separace biotinylovaných PCR produktů dle Holmberga a kol. (2005):

1. 
   Před použitím bylo odpipetováno potřebné množství nosičů (dle počtu vzorků;
   na 1 vzorek/20 l kuliček z výše uvedených ředěních). Magnetické nosiče byly odseparovány magnetem (1–2 minuty/laboratorní teplota) a supernatant byl odpipetován.
   

2. 
   Nosiče byly resuspendovány ve stejném objemu 2 koncentrovaného PBS pufru.
   

3. 
   20 l nosičů jednotlivých ředěních bylo odpipetováno a smícháno s 20 l biotinylovaného PCR produktu. Směs byla řádně promíchaná a inkubována
   při laboratorní teplotě po dobu 15 min.
   
4. 
   Komplex (magnetické nosiče s navázaným PCR produktem) byl odseparován
   1–2 minuty/LT. Supernatant byl odpipetován a použit jako kontrola pro agarózovou gelovou elektroforézu.
   
5. 
   Nosiče byly promyty ve 100 l TE pufru a odseparovány magnetem. Supernatant byl odpipetován.
   
6. 
   Byl zopakován krok č. 5.
   
7. 
   Nosiče byly resuspendovány ve 20 l PCR vody.
   
8. 
   Směs byly zahřátá na teplotu 70 °C/5 minut.
   
9. 
   Magnetem byly odseparovány nosiče (použité pro uvolnění PCR produktů), PCR produkty přítomné v eluátu byly odebrány do čisté eppendorfky a použity pro gelovou elektroforézu.
   

Schématické znázornění izolace biotinylovaných PCR produktů pomocí magnetických nosičů s navázaným streptavidinem je znázorněno na Obrázku 4.

Obrázek 4. Separace biotinylovaných PCR produktů (upraveno dle Holmerga a kol. 2005).3

Jako kontrola byly použity magnetické nosiče MPG^ Streptavidin (10 mg/ml):

Na každý vzorek bylo použito 100 g nosičů (v objemu 10 l), byly odseparovány magnetem a resuspendovány ve 2 koncentrovaném PBS pufru na koncentraci 5 mg/ml. Separace biotinylovaných PCR produktů pomocí magnetických nosičů

MPG^ Streptavidin probíhala stejným způsobem jako při použití magnetických nosičů PGMA-NH₂-STV.