Vysoké UČENÍ technické V brně

10Materiál a metody

10.1Rostlinný materiál

Pro experiment byly použity rostliny okřehku menšího (Lemna minor L.), jehož vědecké zařazení je uvedeno v tab. 10.1.

Tabulka 10.1
Vědecká klasifikace okřehku menšího (Lemna minor L.)

Říše	rostliny (Plantae)
Podříše	cévnaté rostliny (Tracheobionta)
Oddělení	krytosemenné (Magnoliophyta)
Třída	jednoděložné (Liliopsida)
Řád	žabníkotvaré (Alismatales)
Čeleď	áronovité (Araceae)
Rod	okřehek (Lemna)
Druh	okřehek menší (Lemna minor L.)

Bližší charakteristika o rostlinném materiálu je uvedena v kapitole 8.

10.2Experiment

10.2.1Předkultivace okřehku menšího

Kultura okřehku menšího, před následným využitím pro test fytotoxicity, se kultivovala po dobu 10 dní ve Steinbergově modifikovaném médiu (SMM), jehož složení je uvedeno v tab. 11.2. Hodnota pH byla upravena na 5,5 ± 0,2 přídavkem malého objemu roztoku NaOH nebo HCl. SMM bylo vysterilizováno autoklávováním při teplotě 120°C po dobu 20 minut.

Okřehek, který se používá pro testy fytotoxicity, by měl splňovat určitá níže uvedená kritéria:

• 
  exponenciální růst;
  
• 
  počet stélek v předkultivaci se má zvýšit do konce sedmého dne sedmkrát;
  
• 
  kultura se má skládat z mladých, rychle rostoucích kolonií světle zelené barvy bez viditelných poškození, chlorózy nebo nekrózy;
  
• 
  velký počet jednotlivých stélek nebo malých kolonií je známkou environmentálního zatížení a tyto rostliny se nemají používat při testování;
  
• 
  všechny použité kolonie mají pocházet ze stejné předkultivace.
  

Tabulka 10.2
Steinbergovo modifikované médium (převzato a upraveno podle ČSN ISO 20079)

LÁTKA		ŽIVNÉ MÉDIUM
Makrosložky	Relativní molekulová hmotnost	µg/l	mmol/l
KNO3	101,12	350,00	3,46
Ca(NO3)2 · 4H2O	236,15	295,00	1,25
KH2PO4	136,09	90,00	0,66
K2HPO4	174,18	12,60	0,07
MgSO4 · 7H2O	246,37	100,00	0,41
Mikrosložky	Relativní molekulová hmotnost	µg/l	µmol/l
H3BO3	61,83	120,00	1,94
ZnSO4 · 7H2O	287,43	180,00	0,63
Na2MoO4 · 2H2O	241,92	44,00	0,18
MnCl2 · 4H2O	197,84	180,00	0,91
FeCl3 · 6H2O	270,21	760,00	2,81
EDTA, disodná sůl, dihydrát	372,24	1500	4,03

10.2.2Předběžný test

Předběžný test s kulturou okřehku menšího byl využit pro posouzení (screening) vlivu, jak zvyšující se koncentrace kadmia 1 – 10 – 100 µg/l, tak i pH 3,5 – 4,5 – 5,5 – 7,5 na růst kultury. Test byl proveden v makrotitračních destičkách. Každá destička má 6 jamek, objem jedné jamky je 15 ml (Obr. 10.1). Přibližně stejné rostliny byly kultivovány v 10 ml roztoku SMM bez (kontrola) a s přídavkem kadmia. Každá koncentrace kadmia byla upravena na pH 3,5 – 4,5 – 5,5 – 7,5. Počet rostlin v každé jamce byl 6.
Obrázek 10.1

Makrotitrační destička s okřehek menším (Fotografie Ustohalová)

10.2.3Založení experimentu

Přibližně stejné rostliny, 6 rostlin na jamku, byly pomocí párátka umístěny do makrotitračních destiček a kultivovány v 10 ml SMM bez (kontrola) a se zvyšujícím se obsahem kadmia (0,1 – 1 – 10 µg/l) a zvoleným pH roztoku (3,5 – 4,5 – 5,5 – 7,5). Po sterilizaci SMM autoklávováním při teplotě 120°C po dobu 20 minut byly upravovány hodnoty pH malým přídavkem objemu NaOH a HCl. Kultivace probíhala v řízených podmínkách (teplota 22 ± 2°C, relativní vzdušná vlhkost 60%, ozářenost 150 µmol/m²/s, fotoperioda 12/12). Každé zatížení kadmia a každé pH bylo reprezentováno 6 opakováními.