Vježba 6: Mikroskop I mikroskopiranje

Vježba 6: Mikroskop i mikroskopiranje Vježbe iz Prirodoslovlja

____________________________________________________________________________________________________________

Vježba 6: Mikroskop i mikroskopiranje
Mikroskop (grč. mikros-malen, sitan; skopeo-gledam) je optički instrument koji se upotrebljava za promatranje objekata koje nije moguće vidjeti golim okom.

Razvoj mikroskopa:

• 
  1600. god. Zacharias i Hans Janssen konstruirali prvi složeni mikroskop (okular i objektiv)
  
• 
  1625. god. Giovanni Faber - daje naziv mikroskopu
  
• 
  1665. god. Robert Hooke - primitivnim mikroskopom otkrio žive stanice pluta
  
• 
  1674. god. Antony van Leeuwenhoek pomoću jednostavnog mikroskopa (bikonveksna leća umetnuta između mjedenih ploča) otkrio nevidljive oblike života - “najsitnije životinje” tj. mikroorganizme, promatrao bakterije, spermije i krvne stanice, smatra se ocem mikroskopije i mikrobiologije
  

Mikroskopi koji se danas koriste sastavljeni su od niza optičkih i mehaničkih djelova, a u osnovi razlikujmo dva tipa: svjetlosni (optički) i elektronski mikroskop.
Svjetlosni (optički) mikroskop:

Danas postoji nekoliko vrsta svjetlosnih mikroskopa: mikroskop sa svijetlim vidnim poljem, mikroskop s tamnim vidnim poljem, fluorescentni mikroskop, fazno-kontrastni mikroskop. Svi oni imaju neke zajedničke optičke i mehaničke dijelove. Svjetlosni mikroskop sastoji se najmanje od dvaju sustava leća: objektiva koji povećava uzorak i okulara koji povećava sliku što je dobivena od objektiva. Kao izvor svjetlosti u mikroskopu se upotrebljava vidljivi dio spektra prirodne ili umjetne svjetlosti. Svjetlosni mikroskop se upotrebljava za istraživanje vrlo sitnih objekata (poput stanice), ali i njihovih finih detalja (jezgra, kromosomi).

Elektronski mikroskop:

Umjesto leća i objektiva koristi zraku elektrona koju usmjerava fokusirajući elektromagnetsko polje. Granica razlučivosti elektronskog mikroskopa je 0,1 - 0,2 nm što omogućava viđenje mnogo detaljnije slike (200 - 350 nm kod svjetlosnog mikroskopa). Elektronski mikroskop omogućuje velika povećanja (100 000 ×) tankih presjeka preparata (režu se ultramikrotomom, debljine do 20 nm). Elektronska mikroskopija omogućila je promatranje i proučavanje staničnih organela poput membrane, ribosoma, mikrotubula i mikrofilamenata. Dva su osnovna tipa:

1. 
   TEM (transmisijski elektronski mikroskop) – oblikuje sliku pomoću elektrona koji prolaze kroz objekt promatranja.
   
2. 
   SEM (skenirajući elektronski mikroskop) - skenira površinu preparata te sliku oblikuje otkrivajući elektrone koji se odbijaju od vanjske površine preparata, promatranjem struktura stječe se dojam dubine.
   

Dijelovi svjetlosnog mikroskopa:

Mehanički dijelovi mikroskopa:

1. postolje (podloga)

2. stativ (ručica)

3. tubus s revolverom

4. stolić mikroskopa

5. makrovijak i mikrovijak

6. uređaj za osvjetljavanje

Optički dijelovi mikroskopa:

1. okular

2. objektiv

3. kondenzor

4. iris-zaslon

Mehanički dijelovi mikroskopa:

Stativ je metalni dio mikroskopa u donjem dijelu proširen i čini postolje i daje stabilnost mikroskopu. Savijeni dio stativa je ručica koja služi za držanje i prenošenje mikroskopa. Na stolić mikroskopa postavlja se preparat kojeg osvjetljavaju zrake svjetlosti koje prolaze kroz otvor na stoliću. Stolić može biti pokretan ili se preparat može pomicati rukom. Tubus je metalna cijev na čijem vrhu se nalazi okular, a na dnu je pričvršen revolver s objektivima. Makrovijak se koristi pri manjim povećanjima i služi za traženje slike predmeta, a mikrovijakom se izoštrava slika promatranog predmeta.

Ogledalo usmjerava zrake svjetlosti na preparat. Može se okretati u različitim smjerovima te je s jedne strane udubljeno (koristi se pri dnevnoj svjetlosti), a s druge ravno (umjetna svjetlost).
Optički dijelovi mikroskopa:

Objektivi i okulari su sustavi centriranih leća uloženih u kratki cilindar. Objektivi se navojima pričvrste za revolver. Na svakom objektivu urezana je brojka koja označava njegovu sposobnost uvećanja. Mogu biti suhi i imerzijski. Kod suhih objektiva (povećavaju 4x, 10× i 40×) između leća i preparata se nalazi zrak, a imerzijski (povećavaju 90×, 100×) su oni u čiju se frontalnu leću stavlja kap imerzijskog ulja (cedrovo) da bi se mogao promatrati zadani objekt. Okular se nalazi na gornjem dijelu tubusa također s urezanim brojem koji označava sposobnost uvećanja (7×, 10×, 15×). Mikroskopi s jednim okularom nazivaju se monokularni, a oni s dva binokularni.

Ukupno povećanje mikroskopa dobiva se tako da se pomnoži povećanje objektiva s povećanjem okulara. Objektiv daje povećanu, obrnutu i realnu sliku predmeta, a okular tu realnu sliku, poput lupe, još poveća.

Kondenzor sakuplja svjetlosni snop koji dolazi od ogledala i širi ga. Kod mikroskopiranja je potrebno, ovisno o prirodi preparata, mijenjati širinu stošca svjetlosti koja obasjava preparat. To se postiže pomoću iris-zastora. On se nalazi u blizini donje žarišne ravnine kondenzora. U pravilu, obojene preparate obasjavamo širim snopom zraka svjetlosti, a neobojene užim. Sitne pojedinosti u preparatu postaju vidljive zato što su obojene (apsorpcija svjetlosti određenih valnih duljina, priroda boje) ili zato što imaju drugačiji indeks loma od okoline (difrakcijsko-refrakcijska slika). Preparat najprije pregledamo s potpuno otvorenim iris-zastorom, a zatim zatvaramo iris-zastor dok ne postignemo optimalan kontrast. Kod slabijih objektiva (suhi objektivi) iris-zastor treba suziti, a kod jačih (imerzijski objektiv) treba ga otvoriti.

Pravila pri radu s mikroskopom:

1. 
   Uzimanje i prenošenje mikroskopa vrši se isključivo držanjem za ručicu i postolje istovremeno.
   
2. 
   Prije uporabe i nakon završetka rada, mikroskop je potrebno očistiti mekom krpom od prašine i nečistoća.
   
3. 
   Visina stola i stolice treba biti namješetena tako da je mikroskopiranje ugodno i bez napora.
   
4. 
   Osobe koje nose naočale, mikroskopiraju bez njih.
   
5. 
   Nakon završenog mikroskopiranja preparat se odnosi sa stolića, objektiv se vraća na najmanje povećanje i mikroskop se sprema.
   

Izrada mikroskopskog preparata:

Mikroskopski preparat može biti privremen ili trajan, ovisno o vrsti i namjeni. Za potrebe ovih vježbi izrađivat će se privremeni preparati. Svaki mikroskopski preparat sastoji se od predmetnog stakalca (predmetnice) i pokrovnog stakalca (pokrovnice). Predmet koji želimo promatrati mora biti tanak i proziran da bi zrake svjetlosti mogle proći kroz njega. Obično se predmet promatranja postavlja u kapljicu vode na predmetnom stakalcu te se pokriva predmetnicom. Pri tome treba paziti da ne zaostanu mjehurići zraka između predmetnice i pokrovnice.

Postupak mikroskopiranja:

1. 
   Započnite mikroskopirati s najslabijim objektivom.
   
2. 
   Spustite pažljivo tubus (velikim vijkom) tako da leća objektiva bude oko 0,5 cm udaljena od preparata. (Pri spuštanju tubusa ne smijete gledati u objektiv da ne biste udarili u preparat te ga razbili i oštetili objektiv.) Provjerite je li rasvjeta dobro namještena!
   
3. 
   Gledajući u okular podižite tubus (velikim vijkom) dok se u vidnom polju ne pojavi slika preparata. FOKUSIRAMO UVIJEK ODOZDO PREMA GORE!
   
4. 
   Izoštrite sliku predmeta, prema potrebi, malim vijkom. Pomičite preparat i dobro ga promotrite, pa odaberite mjesto koje želite pobliže istražiti pomoću jačih objektiva.
   
5. 
   Okrenite revolver i namjestite jači objektiv (10x ili 40x), a zatim samo malim vijkom izoštrite sliku.
   
6. 
   Sliku predmeta koju vidite nacrtajte u za to predviđeni prostor.
   

Mikroskopiranje i bojenje stanica

Zadatak 1: Promatranje barskih algi
Barske alge mogu biti jednostanične i višestanične. Različitog su oblika, a žive pojedinačno ili u obliku manjih ili većih nakupina. Ima ih dosta u sastavu planktona stajačih voda. Gotovo uvijek su prisutne i u akvarijskoj vodi.
Potreban pribor i materijal: mikroskop i pribor za mikroskopiranje, kapaljka, barska voda s algama.

Tijek pokusa: Kapaljkom uzmite kap vode iz bočice s barskom vodom. Kapnite na predmetnicu, prekrijte pokrovnicom i mikroskopirajte pod malim, a zatim pod velikim povećanjem.



Nadcarstvo: Eukarioti (Eucaryota)

Carstvo: Protisti (Protista)
Zadatak 2: Promatranje morskog zooplanktona
Skoro svi životinjski organizmi koji žive u moru prođu kroz stadij zooplanktona bilo kao odrasle jedinke ili barem u stadiju ličinke. Zooplankton je raznovrstan po sistematskim kategorijama, ali ne pokazuje bogatstvo oblika.
Potreban pribor i materijal: mikroskop i pribor za mikroskopiranje, kapaljka, morska voda.

Tijek pokusa: Kapaljkom uzmite kap vode iz bočice s morskom vodom. Kapnite na predmetnicu, prekrijte pokrovnicom i mikroskopirajte pod malim, a zatim pod velikim povećanjem.


Nadcarstvo: Eukarioti (Eucaryota)

Carstvo: Biljke (Plantae)
Zadatak 3: Promatranje stanica pokožice crvenog luka (Allium cepa)
Potreban pribor i materijal: mikroskop i pribor za mikroskopiranje, iglica, skalpel, pinceta, kapaljka, lukovica (podzemna stabljika), voda, otopina eozina, ocat

Tijek pokusa: uzmite mesnati list crvenog luka i s unutarnje strane skalpelom pažljivo izrežite kvadratić pokožice. Pomoću iglice stavite pokožicu na predmetnicu u kap vode. Poravnajte pokožicu, prekrijte pokrovnicom i mikroskopirajte pod malim, a zatim pod velikim povećanjem.

1. 
   U predviđeni prostor za crtanje nacrtajte oblik stanica, staničnu stijenku, staničnu membranu, vakuolu i jezgru viđene pod malim povećanjem. Pri najvećem povećanju promatrajte strukture u živoj stanici: jezgru, jezgrice, zrnca u citoplazmi te gibanje citoplazme.
   
2. 
   Obojeni preparat – na satno staklo ulijte malo razrijeđenog eozina. U boju unesite kvadratić pokožice luka i okrećite ga iglicom oko 1 minutu. Zatim pokožicu prenesite u razrijeđeni ocat, a onda isperite u čistoj vodi. Ispranu pokožicu stavite na predmetnicu u kap vode, prekrijte pokrovnicom i mikroskopirajte pod malim, a zatim pod velikim povećanjem te sve nacrtajte u za to predviđeni prostor.
   

neobojeni preparat obojeni preparat

Nadcarstvo: Eukarioti (Eucaryota)

Carstvo: Životinje (Animalia)
Zadatak 4: Promatranje stanica pločastog epitela sluznice usne šupljine čovjeka
Potreban pribor i materijal: mikroskop i pribor za mikroskopiranje, čačkalica, karmin-octena kiselina (ili metilensko modrilo)

Tijek pokusa: Čistom čačkalicom postružite površinu vlastitog jezik ili malo sluzi s unutrašnje strane usne šupljine. Sluz stavite na predmetnicu bez dodavanja vode. Preparat obojite karmin-octenom kiselinom (ili metilenskim modrilom) radi bolje vidljivosti stanica. Malo pričekajte da se boja osuši, prekrijte pokrovnicom i promatrajte prvo pod manjim, a zatim pod većim povećanjem.

U predviđeni prostor za crtanje nacrtajte oblik stanica i stanične strukture koje ste uočili.

Nadcarstvo: Eukarioti (Eucaryota)

Carstvo: Biljke (Plantae)
Zadatak 5: Promatranje epiderme tradenskancije (puzavca)
Potreban pribor i materijal: mikroskop i pribor za mikroskopiranje, žilet, pinceta, kapaljka, Lugolov reagens, puzavac

Tijek pokusa:

a) S površine naličja lista puzavca, koji ste presavinuli preko prsta, žiletom odrežite što tanji sloj pokožice ili ga pažljivo odljuštite. Pomoću iglice stavite pokožicu na predmetnicu u kap vode. Poravnajte pokožicu, prekrijte pokrovnicom i mikroskopirajte s najmanjim povećanjem.

Pokožica je sastavljena od stanica nepravilna oblika među kojima je večina crvene boje. Među tim stanicama potražite manje, zelene stanice, oblika sjemenke graha. To su stanice zapornice, koje zatvaraju puči. Postavite stanice zapornice u sredinu vidnog polja i promatrajte ih pri srednjem povećanju. U stanicama zapornicama nalaze se kloroplasti, okruglasta zrnca u kojima je zelena boja – klorofil. Nacrtajte stanice zapornice s kloroplastima.

b) S površine lica lista puzavca skinite sloj stanica i promatrajte ih mikroskopom. Oko jezgre trebate uočiti bezbojna zrnca – leukoplaste. Nakon što ste uočili leukoplaste, obojite preparat Lugolovom otopinom. Nacrtajte leukoplaste.

c) Ostružite žiletom prerezani gomolj krumpira ili sjemenku graha te dobivenu smjesu s škrobnim zrncima nanesite na predmetnicu. Na predmetno staklo stavite kap destilirane vode i vrhom igle prenesite u nju zrnca škroba. Proučite preparat (obj. 40x) i nacrtajte nekoliko zrnaca škroba Nakon toga dodajte kap Lugolove otopine uz rub pokrovnice, a filter-papirom, kojeg ste prislonili uz pokrovnicu na suprotnoj strani upijte višak vode, da bi otopina brže prodrla u preparat.