Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc aspergillus spp. Sinh tổng hợp enzyme invertase

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MỐC Aspergillus spp.

SINH TỔNG HỢP ENZYME INVERTASE

SCREENING OF ASPERGILLUS SPP. PRODUCING INVERTASE

Nguyễn Văn Giang^*, Phạm Thùy Trang, Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Đức Thái, Thái Thị Hà Phương, Đặng Quang Cảnh.

Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

^*E-mail: [e-mail]

TÓM TẮT

Invertase (β-fructofuranosidase E.C.3.2.1.26) là enzyme có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân sucrose thành glucose và fructose nên được ứng dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm. Nghiên cứu này nhằm mục đích tuyển chọn các chủng nấm mốc Aspergillus spp. có khả năng sinh enzyme invertase và khảo sát một số đặc tính của enzyme này. Từ các nguồn mẫu khác nhau chúng tôi đã phân lập được 16 chủng có khả năng tổng hợp enzyme invertase trong đó chủng O1, L1.2 biểu hiện hoạt tính invertase cao nhất. Hai chủng O1 và L1.2 có khả năng sinh tổng hợp enzyme tốt nhất ở 35^oC và pH 6,5 với nguồn nitrogen là urea đối với chủng L1.2 và NaNO₃ đối với chủng O1, nguồn carbon là sucrose đối với chủng L1.2 còn với O1 là fructose. Enzyme invertase của chủng O1 hoạt động tối ưu ở 50^oC, pH 5,5; đối với chủng L1.2 enzyme này hoạt động tốt nhất ở 40^oC, pH 6. Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính của enzyme này tăng lên khi bổ sung Mn²⁺.

Từ khóa: Enzyme invertase, Aspergillus spp., hoạt tính enzyme,

SUMMARY

Invertase (β-fructofuranosidase E.C.3.2.1.26) catalyzes the hydrolysis of sucrose to glucose and fructose so it is mainly used in the food industry. This study was conducted to isolate and screen fungal strains Aspergillus spp. which have invertase activity and study some biochemical characterization of invertase enzyme. From different samples, we isolated 16 fungal strains which have the ability synthesis invertase enzyme with O1, L1.2 expressing highest activity. Strains O1 and L1.2 produced high levels of invertase enzyme under optimized culture conditions at an optimum temperature 35^oC, pH 6,5 with ure as nitrogen source and sucrose as carbon source. Enzyme invertase of strain O1 exhibited optimum at temperature 50^oC, pH 5,5; strain L1.2 exhibited optimum at temperature 40^oC, pH 6. This research showed that the activity of this enzyme increases as additional Mn²⁺.

Key word: Invertase enzyme, Aspergillus spp., , enzyme activity,

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Invertase (EC3.2.1.26) là một enzyme thuộc họ GH 32 của glycoside hydrolase (Alberto et al. 2004), nó còn được biết đến với các tên gọi khác như: β-fructofuranosidase, saccharase, glucosucrase, sucrase, β –fructosidase. Invertase có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân sucrose thành glucose và fructose (tỉ lệ 1:1) gọi là đường nghịch đảo. Invertase được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm đặc biệt là ngành sản xuất bánh kẹo và nước giải khát do đường nghịch đảo ngọt hơn và ít kết tinh hơn so với đường sucrose. Ngoài ra, invertase còn được ứng dụng trong sản xuất đường fructooligosaccharide (FOS) – là loại đường có chức năng làm giảm cholesterol, phospholipid và triglycerides trong máu, cũng như làm giảm huyết áp tâm trương (Nguyen et al, 2005). Invertase là một enzyme được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như thực vật, vi khuẩn, nấm men Saccharomyces và một số vi nấm như Aspergillus niger (Rubio và Navarro, 2006). Tuy nhiên nghiên cứu trong nước về các chủng Aspergillus sinh tổng hợp invertase còn hạnchế nên chúng tôi thực hiện nghiên cứu này nhằm mục đích phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc Aspergillus spp. có khả năng sinh enzyme invertase và khảo sát một số đặc tính của enzyme này.

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. 
   Vật liệu thí nghiệm.
   

Vật liệu phân lập nấm mốc: các chủng nấm mốc được phân lập từ các nguồn vật liệu khác nhau: mẫu lá mục, lạc, gạo, tổ ong mốc, vỏ chanh được lấy từ các khu vực và địa điểm khác nhau: Hà Nội, Nam Định.

2. Phương pháp nghiên cứu.

Các chủng nấm mốc Aspergillus được phân lập theo phương pháp Ulster (Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, 2000) trên loại môi trường phân lập là PDA và Czapek-Dox. Sau đó làm thuần bằng cách cấy truyền trên môi trường PDA. Các chủng nấm mốc Aspergillus được nuôi lắc trong môi trường Czapek-Dox lỏng pH 5.5 (Sigma- Mỹ), tốc độ lắc 150 rpm, nhiệt độ 35^oC, mật độ tiếp giống 10⁶ bào tử cho 100ml môi trường lên men. Sau 3 ngày nuôi cấy thu dịch nuôi đem li tâm 10000 rpm ở 4^oC trong 20 phút. Phần dịch lỏng thu được sau li tâm sẽ được đưa đi thử hoạt tính enzyme invertase. Dựa vào nguyên lý enzyme invertase có khả năng thủy phân liên kết β-1,2 glucoside của sucrose sản phẩm là glucose và fructose tỉ lệ 1:1. Hoạt tính tương đối của enzyme invertase được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch: phương pháp này sử dụng thuốc thử TTC 0.1% (2,3,5- triphenyl tetrazolium chloride trong NaOH 0,5M). Đường khử (glucose) sinh ra từ quá trình thủy phân sucrose của enzyme invertase sẽ khử TTC thành triphenyformazon có màu hồng, lượng triphenyformazon tỉ lệ thuận với lượng đường khử sinh ra. Giếng thạch được đục trong môi trường cơ chất sucrose 3% trong đệm natri acetate 50mM pH 5,0. Cho 100µl dịch enzyme thô vào vào giếng để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Thuốc thử TTC được thêm vào bằng cách phun lên mặt thạch và ủ trong bóng tối 20 phút, rửa đệm acetate 0,1M pH 5,0. Enzyme invertase khuếch tán vào đĩa thạch sản phẩm thủy phân của nó được khẳng định bằng sự xuất hiện vòng đỏ quanh giếng.

Phương pháp so màu DNS: Ủ hỗn hợp phản ứng gồm 200µl enzyme thô, 500µl dung dịch sucrose 5% và 300µl đệm acetate 50mM pH 5,0 ở 50⁰C trong 30 phút (Bernfeld et al.,1955). 1ml DNS (3, 5-dinitrosalicylic acid) được cho thêm vào hỗn hợp trên và kết thúc phản ứng bằng cách ngâm ống nghiệm trong bể nước sôi 5 phút. Sau khi làm lạnh bằng nước tới nhiệt độ phòng dung dịch phản ứng được dùng để xác định lượng đường khử glucose sinh ra bằng cách đo OD₅₄₀.

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

1. 
   Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh invertase.
   

Từ các nguồn vật liệu mẫu chúng tôi phân lập được 16 chủng nấm mốc có đặc điểm giống với Aspergillus trong đó có 8 chủng khuẩn lạc có màu đen 8 chủng khuẩn lạc có màu xanh rêu, vàng lục. Các chủng nấm mốc được làm thuần và nuôi lỏng lắc trong môi trường Czapek-Dox trong 3 ngày ở 35^oC với mật độ 10⁶ bào tử/ 100ml môi trường. Sau 3 ngày nuôi thu dịch enzyme thô tiến hành xác định hoạt tính bằng khuếch tán đĩa thạch với cơ chất sucrose và thuốc thử TTC 0.1%. Kết quả được trình bày tại bảng 1.

Bảng 1. Kết quả khả năng tổng hợp enzyme invertase của 16 chủng nấm mốc trên môi trường Czapek-Dox

Chủng	Đường kính vòng hoạt tính (mm)	Chủng	Đường kính vòng hoạt tính (mm)
O1	23.67±0.47	G0.2	18.33±0.47
O2	9.00±0.82	L1.1	12.67±0.47
O3	10.67±0.47	L1.2	22.33±0.47
O4	14±0.82	L1.3	6.00±0.82
L1	14.33±0.47	L1.4	13.67±0.47
LB	9±0.82	PL2.1	13.67±0.94
G2.2	21.33±0.47	PL2.2	12.67±0.47
G2.1	14.33±0.94	243	4.33±0.47

Chúng tôi nhận thấy các chủng nấm mốc biểu hiện khả năng thủy phân sucrose khác nhau, trong số 16 chủng nấm mốc tham gia khảo sát, có 2 chủng biểu hiện hoạt tính invertase mạnh nhất là O1 và L1.2 với đường kính vòng phân giải sucrose tương ứng là 23,67 mm và 22,33mm.

2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tổng hợp invertase.

2.1. Ảnh hưởng của pH môi trường

Hình 1. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng tổng hợp invertase

Hình 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng tổng hợp invertase của các chủng Aspergillus

Các chủng Aspergillus được nuôi trên môi trường Czapek-Dox lỏng với các pH thay đổi từ 3 – 10. Sau 3 ngày nuôi, dịch nuôi được ly tâm và thử hoạt tính phân giải sucrose. pH môi trường đã ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và tổng hợp enzyme invertase của các chủng nấm mốc Aspergillus. Các chủng Aspergillus có khả năng sinh trưởng và tổng hợp enzyme invertae ở dải pH khá rộng từ 3-9, trong đó vùng pH từ 5 – 6.5 là thích hợp nhất. Đối với cả hai chủng nấm mốc thì pH tốt nhất để tổng hợp invertase là 6.5 (hình 1)

2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Các chủng nấm mốc Aspergillus được nuôi trên môi trường Czapek – Dox lỏng với pH 6.5 ở các nhiệt độ: 25, 30, 35, 40, 45^oC. Sau khi nuôi 3 ngày thu dịch nuôi đem đi ly tâm để thử hoạt tính phân giải sucrose của các chủng. Các chủng Aspergillus đều có khả năng tổng hợp invertase ở dải nhiệt độ từ 25 - 40^oC, trong đó chủng O1 và L1.2 có khả năng tổng hợp enzyme cao nhất ở 35^oC. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Madhanasundareswari và cộng sự (2015) khi nghiên cứu sản xuất và tối ưu hóa các điều kiện phát triển của chủng nấm mốc sinh enzyme invertase. Tại nhiệt độ 45^oC thì cả hai chủng đều không còn khả năng tổng hợp invertase.

2.3. Ảnh hưởng của một nguồn carbon

Enzyme invertase là enzyme cảm ứng muốn tổng hợp enzyme cảm ứng cần có 4 điều kiện: có gen tương ứng trong nhiễm sắc thể của tế bào, có đầy đủ cơ chất tương ứng để xây dựng các phần tử enzyme, có năng lượng cần thiết cho sự tổng hợp và phải có chất cảm ứng. Nếu không có chất cảm ứng thì có đủ 3 điều kiện trên cũng không thể tổng hợp enzyme. Tổng hợp enzyme chịu ảnh hưởng lớn của các loại đường sử dụng như nguồn carbon và cơ chất cảm ứng sinh enzyme (Ottoni et al., 2012). Các loại đường khác nhau như glucose, frucose, sucrose và raffinose với nồng độ 1% đã được lựa chọn để thu invertase theo như mô tả của Uma et al., (2010). Chủng L1.2 sản xuất invertase nhiều nhất trong môi trường có đường sucrose là nguồn carbon. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Uma et al., (2010) khi nghiên cứu sản xuất, tinh sạch và khả sát đặc tính enzyme invertase từ Aspergillus flavus và kết quả của Ottoni et al (2012) khi nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện sản xuất invertase từ Aspergillus oryzea (hình 3). Trong khi đó với chủng O1 thì nguồn carbon tốt nhất lại là fructose tuy nhiên với nguồn carbon là sucrose thì đường kính vòng hoạt tính cũng tương đương chủng L1.2.

Hình 3. Ảnh hưởng của nguồn carbon khác nhau tới khả năng tổng hợp enzyme invertase

Hình 4. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen tới khả năng tổng hợp invertase

2.4. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen

Nguồn nitrogen và nguồn carbon là hai yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tế bào và sản xuất enzyme của các chủng vi sinh vật (Wen-Chang Chen, Chihsien Liu., 1996). Hai chủng O1 và L1.2 được nuôi lắc trên môi trường Czapek-Dox lỏng ở pH 6.5, nhiệt độ 35^oC, 180 vòng/phút, nguồn carbon là sucrose và thay thế nguồn nitrogen bằng các nguồn nitrogen khác nhau: urea, NaNO₃, pepton và cao nấm men. Các nguồn nitrogen khảo nghiệm đã ảnh hưởng tới sự tổng hợp enzyme invertase của chủng O1 và L1.2 (hình 4). Urea và NaNO₃ là nguồn nitrogen tốt nhất cho sự tổng hợp enzyme invertase của các chủng Aspergillus thí nghiệm, trong khi đó cao nấm nem lại cho kết quả tổng hợp invertase ngoại bào khá thấp mặc dù sinh khối nấm tăng trưởng mạnh. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Ottoni et al 2012 khi nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện sản xuất invertase từ Aspergillus oryzea. Ngược lại Wang và Zhou (2006) cho thấy urea hạn chế cả các hoạt động sản xuất invertase và tăng trưởng sinh khối của chủng Aspergillus sp.JN19 và cao nấm men được chọn làm nguồn nitrogen tốt nhất. Mặt khác, urea cũng được dùng để cải thiện sản lượng invertase sản xuất từ Saccharomyces cerevisiae  (Ikram và Sikander 2007), trong khi Rajoka và Yasmeen (2005) thấy rằng NaNO₃ là nguồn nitrogen nghèo nhất cho sự tổng hợp β -fructofuranosidase bởi A.niger.

3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của invertase

3.1. Ảnh hưởng của pH đệm

Enzyme invertase do các chủng Aspergillus tổng hợp có giải pH hoạt động khá rộng (Nguyen Q D et al, 2005). Chủng O1 hoạt động mạnh nhất ở pH 5.5. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyen.Q.D và cộng sự (2005) khi tiến hành tinh sạch và khả sát một số thuộc tính của of β-fructofuranosidase từ Aspergillus niger IMI303386. Trong khi đó chủng L1.2 hoạt động mạnh ở pH 6 (hình 5)

Hình 5. Ảnh hưởng của pH đệm đến sự phân giải sucrose của enzyme invertase

Hình 6. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của invertase.

3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ.

Nhiệt độ ảnh hưởng tới cấu trúc và hoạt động của enzyme, chính vì vậy biết được nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme là yêu cầu cần thiết. Dịch chiết enzyme thô của các chủng O1 và L1.2 được xử lí các nhiệt độ từ 30^oC đến 80^oC và kiểm tra hoạt tính bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Kết quả (hình 6) cho thấy với nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính của enzyme invertase thô của chủng O1 và L1.2 tương ứng là 50^oC và 40^oC. Sanjay và Sugunan (2006) cho rằng enzyme này hoạt động tối ưu ở 50^oC, pH 5,0. Một số tác giả khác cho rằng invertases hoạt động tối ưu trong phạm vi nhiệt độ rộng 35-75°C tùy thuộc vào nguồn gốc của chúng và thời gian ủ (Kern et al.,1992). Nguyen et al., 2005 báo cáo nhiệt độ tối ưu của invertase từ A. niger là 50°C. Giá trị nhiệt độ tối ưu của invertase cao hơn được báo cáo bởi nhiều tác giả (Rubio et al.,2002; Guimaraes et al.,2007; Hussain et al.,2009) trong khi giá trị thấp hơn (30°C) đã được báo cáo bởi (Rashad et al.,2006).

3.3. Ảnh hưởng của một số ion kim loại.

Các ion kim loại (nồng độ 5 mM) đã được thêm vào hỗn hợp phản ứng một cách riêng biệt. Sự thủy phân của enzyme được đo và so sánh với mẫu đối chứng không có ion kim loại (Rahul Kumar và Balakrishnan Kesavapillai., 2012). Kết quả cho thấy các ion kim loại có ảnh hưởng khá mạnh tới hoạt tính của invertase, hoạt tính được biểu hiện mạnh hơn khi thêm vào các ion Mn^2+, Na⁺, hay Sn²⁺ cũng có tác động đến hoạt tính invertase. Khi bổ sung ion Na+ hoạt tính invertase từ chủng O1 giảm đáng kể so với khi bổ sung các ion Cu^2+, Ca^2+. Ion Zn²⁺ cũng gây ức chế hoạt tính inertase từ hai chủng. Các nghiên cứu khác cũng cho thấy các ion kim loại tác động rất khác nhau tới hoạt tính invertase sản xuất từ các nguồn khác nhau. Shankar, Thangamathi, Rama, Sivakumar (2014) cho kết quả rằng enzyme invertase từ chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae MK hoạt động tối ưu khi có Ca²⁺, trong khi bị ức chế mạnh bởi K⁺. Rahul Kumar và Balakrishnan Kesavapillai (2012) cho thấy enzyme này được tăng hoạt tính với ion Fe³⁺ , Mn²⁺ , nhưng ion Cu²⁺ ức chế hoạt tính của enzyme này.

Hình 8. Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính của enzyme invertase.

IV. KẾT LUẬN

Từ các nguồn mẫu thu thập từ nhiều địa điểm khác nhau chúng tôi phân lập đã được 16 chủng có hoạt tính enzyme invertase, trong đó 2 chủng O1 và L1.2 có hoạt tính cao nhất. Điều kiện môi trường thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp enzyme invertase cao nhất của 2 chủng này cũng đã được xác định: Nguồn carbon và nitrogen tốt nhất với chủng L1.2 và O1 tương ứng là : sucrose và NaNO_3, fructose và urea; pH và nhiệt độ thích hợp cho hai chủng này sinh trưởng, phát triển là 6,5; 35⁰ C. Hoạt tính enzyme invertase biểu hiện tốt nhất tại nhiệt độ 40^oC- 50^oC và pH 5,5- 6. Ion Mg²⁺ đã tăng hoạt tính thủy phân của enzyme invertase.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. 
   Alberto, F., C. Bignon, G. Sulzenbacher, B. Henrissat and M. Czjzek, 2004. The three dimensional structure of invertase (β-fructosidase) from Thermotoga maritime reveals a bimodular arrangement and an evolutionary relationship between retaining and inverting glycosidases. Journal of Biological Chemistry, 279:18903-18910
   
2. 
   Bernfeld, P., S.P. Colowick and N.O. Kaplan, 1955. Amylases a and β, pp. Method in Enzymol. Vol. I, Academic Press Inc., New York, pp: 149-158
   
3. 
   Guimaraes LHS, Terenzi HF, Polizeli MLT, Jorge JA (2007) Enzyme MicrobTechnol 42:52-57
   
4. 
   Hussain A, Rashid MH, Perveen R, Ashraf M (2009) Purification, kinetic and thermodynamic characterization of soluble acid invertase from sugarcane (Saccarumofficinarum). Plant PhysiolBiochem 47:188-194
   
5. 
   Ikram-Ul-Haq, Sikander A., Kinetics of invertase production by Saccharomyces cerevisiae in batch culture. Pak. J. Bot., 39,907-12(2007)
   
6. 
   Kern G, Schülke N, Schmid FX, Jaenicke R (1992) Stability, quaternary structure, and folding of internal, external, and core-glycosylated invertase from yeast. Protein Sci 1:120-131
   
7. 
   Nguyen QD, Rezessy-Szabo JM, Bhat MK, Hoschke A (2005) Purification and some properties of β-fructofuranosidase from Aspergillus niger IMI303386. Process Biochem 40:2461-2466
   
8. 
   Ottoni C. A.; R. Cuervo-FernándezII; R. M. PiccoliI; R. MoreiraI; B. Guilarte-MaresmaII; E. Sabino da SilvaI; M. F. A. RodriguesI; A. E. Maiorano. Media optimization for β-Fructofuranosidase production by Aspergillus oryzae. Braz. J. Chem. Eng. vol.29 no.1 São Paulo Jan./Mar. 2012
   
9. 
   Rahul Kumar and Balakrishnan Kesavapillai.(2012). Stimulation of extracellular invertase production from spent yeast when sugarcane pressmud used as substrate through solid state fermentation.
   
10. 
    Rajoka, M. I., Yasmeen, A. (2005). Improved productivity of β-fructofuranosidase by a derepressed mutant of Aspergillus niger from conventional and non-conventional substrates. Word J. Microbiol. Biotechnol., 21,471-78.
    
11. 
    Rashad MM, Mahmoud AEE, Desouky MA, Nooman MU (2006). Purification and characterization of extra and intracellular β-fructofuranosidase from Saccharomyces cerevisiae growing on Eichhorniacrassipes leaf extract. Deutsche Lebensmittel Rundschau 102:157-166
    
12. 
    Rubio MC, Runco R, Navarro AR (2002) Invertase from a strain of Rhodotorula glutinis. Phytochemistry 61:605-609.
    
13. 
    Sanjay G, Sugunan S (2006). Enhanced pH and thermal stabilities of invertase immobilized on montmorillonite K-10. Food Chem 94:573-579
    
14. 
    Shankar T., P. Thangamathi, R. Rama, T. Sivakumar (2014). Characterization of Invertase from Saccharomyces cerevisiae MK obtained from toddy sample.
    
15. 
    Uma C., D. Gomathi, C. Muthulakshmi and V.K. Gopalakrishnan. Production, Purification and Characterization of Invertase by Aspergillus flavus Using Fruit Peel Waste as Substrate. Advances in Biological Research 4 (1): 31-36, 2010
    
16. 
    Wang, L. M., Zhou, H. M. (2006). Isolation and identification of a novel Aspergillus japonicus JN19 producing β-fructofuranosidase and characterization of the enzyme. J. Food Biochem., 30,641-58.
    
17. 
    Wen-chang Chen and Chi-hsien Liu 1996. Production of P-fructofuranosidase by Aspergillus japonicus. Enzyme and Microbial Technology 18:153-160, 1996.