Microsoft Word 63770195-file00

11 

 

in an effective time interval of 2.6 sec (detailed description on SIM adjustments for time lapsed 

253 

imaging are in Materials and Methods section). This interval is well within accepted published 

254 

range required to resolve microtubule dynamics (e.g., Shaw et al., 2003; Buschmann et al., 2010) 

255 

and it was uniformely used as a standard time interval to acquire time lapsed series of cortical 

256 

microtubule dynamics in all other microscopies used hereby (WF, CLSM, TIRF and SD) as 

257 

specified in Materials and Methods section. In all cases of imaging the acquisition settings were 

258 

adjusted towards optimal lateral resolution for the given time frame. 

259 

Again the spatial resolution was quantitatively defined by recording the FWHM of a number of 

260 

averaged, co-aligned and finally normalized transverse intensity profiles centered on individual 

261 

microtubules. For GFP-MBD labeled microtubules the recorded resolution of SIM was 135

±11 

262 

nm (mean

±SD; n=41; Fig. 4A), while for WF was 226±8 nm (mean±SD; n=41; Fig. 4C), for 

263 

CLSM was 238

±11 nm (mean±SD; n=41; Fig. 4E), for TIRF was 274±14 nm (mean±SD; n=41; 

264 

Fig. 4G) and for SD it was 323

±21 nm (mean±SD; n=54; Fig. 4I). With the SIM module GFP-

265 

TUA6 labeled microtubules were resolved at 133

±8 nm (mean±SD; n=71; Fig. 4B) while the 

266 

respective resolution for WF was 225

±16 nm (mean±SD; n=71; Fig. 4D), for CLSM was 305±19 

267 

nm (mean

±SD; n=43; Fig. 4F), for TIRF was 283±19 nm (mean±SD; n=47; Fig. 4H) and for SD 

268 

was 309

±21 nm (mean±SD; n=83; Fig. 4J). The above values correspond to previously published 

269 

information on the resolution in above mentioned microscopic techniques (e.g., Zucker et al., 

270 

1999; Wang et al., 2005). From these data it was concluded that the resolution of SIM, even after 

271 

the compromises for time-lapsed imaging, significantly exceeded that of WF, CLSM, TIRF and 

272 

SD. Since SIM clearly outperformed all other techniques, next sections are focused on time-

273 

lapsed SIM for quantitative dynamic imaging of cortical microtubules. 

274 

In quantitative terms, cortical microtubules of hypocotyl epidermal cells stably transformed with 

275 

GFP-MBD or GFP-TUA6, exhibited alternating periods of growth succeeded by fast shrinkage 

276 

(e.g., Figs. 5A, B, E, F; Figs. S6A to S6D and Videos S1 and S2). This behavior of cortical 

277 

microtubules was best illustrated by respective kymographs (Figs. 5C, D, G, H). Moreover, 

278 

kymographs of GFP-TUA6 labeled microtubules exhibiting dynamics at both ends, revealed the 

279 

appearance of successive bright and dark stripes which remained vertical throughout the entire 

280 

observation time (Figs. 5G, H). Such stripes correspond to the discontinuous incorporation of 

281 

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---

12 

 

GFP-TUA6 in the microtubule lattice as previously described (Figs. 1B, S1D, S2A and S2C; see 

282 

also Kner et al., 2009). The rates of growth and shrinkage were extrapolated from kymographic 

283 

analyses of the highly dynamic plus end and the less dynamic minus end. The respective growth 

284 

and shrinkage rate of the plus end of individual GFP-MBD-labeled microtubules were 6.15

±3.06 

285 

μm/min (mean±SD; n=65; Fig. 5O; Tables S1 and S2) and 17.65±7.39  μm/min (mean±SD; 

286 

n=65; Fig. 5O; Tables S1 and S2), while at the minus end GFP-MBD-labeled microtubules were 

287 

growing and shrinking at 1

±0.98 

μm/min (mean±SD; n=41; Fig. 5O; Tables S1 and S2) and 

288 

0.97

±0.95 

μm/min (mean±SD; n=33; Fig. 5O; Tables S1 and S2). In the case of GFP-TUA6-

289 

labeled microtubules, the plus end was growing and shrinking at 7.84

±3.59 

μm/min (mean±SD; 

290 

n=63; Fig. 5O; Tables S1 and S2) and 18.22

±5.74 

μm/min (mean±SD; n=41; Fig. 5O; Tables S1 

291 

and S2) respectively. At the minus end the respective rates were 1.7

±1.74 

μm/min (mean±SD; 

292 

n=23; Fig. 5O; Tables S1 and S2) and 1.19

±1.12 

μm/min (mean±SD; n=26; Fig. 5O; Tables S1 

293 

and S2). As illustrated (Fig. 5O) and summarized in Tables S1 and S2, the above measurements 

294 

are within previously published rates of microtubule growth and shrinkage for both constructs 

295 

(e.g., Dhonukshe and Gadella, 2003, Shaw et al., 2003, van Damme et al., 2004, Vos et al., 2004) 

296 

suggesting that SIM can provide a new tool for time lapsed imaging of cortical microtubule 

297 

dynamics offering significantly higher resolution than commonly used techniques. 

298 

Frequently in kymographs from SIM recordings, short length growth and shrinkage events were 

299 

observed. Such length changes were ca. 200 nm (e.g., Fig. 5C) and they were smaller than the 

300 

resolution limits reported for time-lapsed WF, CLSM, TIRF and SD. Such events were also 

301 

taken together for calculating catastrophe and rescue frequencies of individual microtubules 

302 

according to published procedures (Dhonukshe and Gadella, 2003). Moreover, catastrophe and 

303 

rescue frequencies were comparatively measured between SIM and WF because such images 

304 

were acquired simultaneously. 

305 

The overall catastrophe frequency of GFP-MBD-labeled microtubule plus ends was 0.020 

306 

events/s and the rescue frequency was 0.022 events/s when measured on WF acquisitions. With 

307 

SIM the catastrophe and rescue frequencies which were measured for the same microtubules as 

308 

for WF were 0.031 events/s and 0.033 events/s respectively (n=30 microtubules representing 47 

309 

minutes of observation).  

310 

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---