34
AURAM‹NE – RHODAM‹NE FLORESAN BOYAMA
Dr. Vildan AVKAN O⁄UZ
DEÜ T›p Fakültesi ‹nfeksiyon Hastal›klar› ve Klinik Mikrobiyoloji AD.
Direkt mikroskopi teknikleri konusunun giriflinde verilen genel bilgiler ve
yayma preparat›n haz›rlanmas› aflamalar› hem karbol fuksin boyama hem
florokrom boyama yöntemlerinde ayn›d›r. Rutinde tan› amaçl› en s›k karbol
fuksinli (Erlich Ziehl Neelsen- EZN , Kinyon) boyama kullan›lmakla birlikte, daha
duyarl› ve haz›rlanan preparat›n daha h›zl› taranmas›n› sa¤layan florokrom
boyalar da kullan›labilir. Bu boyama yöntemlerinde, daha küçük bir büyütme ile
daha genifl bir alan taranabilir ve preparat›n taranmas› için gereken zaman azal›r.
Bu nedenle özellikle zaman problemi olan ve fazla say›da hasta örne¤inin
ifllemlendi¤i laboratuvarlarda, florokrom boyama yöntemleri hem tan› için hem
de antitüberküloz tedavi alan hastalar›n izleminde tercih edilebilir.
Florokrom boyamada ana ilke fenollü fuksin yerine floresan boyalar›n
kullan›lmas›d›r. Floresan boyalar, mikobakterilerin lipitten zengin hücre duvar›na
ba¤lanarak, görünür hale gelmesini sa¤lar. Ancak boyalar›n haz›rlanmas›,
amaçlanan hedef (doku, mikroorganizma, antijen antikor kompleksi vs.) ve
boyama ifllemi s›ras›nda ›s›-süre de¤iflikliklerinin uygulanmas› gibi, baz› kriterlere
göre, farkl› floresan boyama yöntemleri uygulanabilir. Bu yöntemler aras›nda
Auramin-Fenol boyama yöntemi, Glikerson ve Kanner’in floresanl› boyama
yöntemi, Auramine-Rhodamine boyama yöntemi, Truant’›n modifiye Auramine-
Rhodamine boyama yöntemi say›labilir. Kullan›lan auramin’in karsinojen oldu¤u
unutulmamal›, özellikle direkt temas-hava yolu izolasyon önlemleri al›nmal›d›r.
AURAM‹N-RHODAM‹NE BOYAMA ‹fiLEM BASAMAKLARI
A. Örneklerin Haz›rlanmas› : Karbol Fuksin boyama yönteminde anlat›ld›.
B- Kimyasal Maddelerin Haz›rlanmas›
35
2.Asit Alkol Haz›rlanmas›
Etil alkol (% 70’lik) ---------- 99.5 ml
Konsantre HCl------------------ 0.5 ml
3.Karfl›t Boya Çözeltisi Haz›rlanmas›
Potasyum permanganat (KMnO4) --------- 0.5 gr
Distile su--------------------------------------- 100 ml
C- Kalite Kontrol
Her boyama için mutlak pozitif ve negatif kontroller haz›rlanmal›d›r.
Pozitif kontrol haz›rlanmas›: Middleebrook 7H9 s›v› besiyeri içinde mikobakteri
(mümkünse standart M tuberculosis H37Rv) süspansiyonu haz›rlan›r.Bu
süspansiyondan lam üzerine bir damla konularak ya ›s›t›c› blokta ya da havada
kurutulup, tespit edilir.
Negatif kontrol haz›rlanmas›: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa ile s›v› besiyerinde haz›rlanan süspansiyondan bir damla lam üzerine
konularak ya ›s›t›c› blokta ya da havada kurutulup, tespit edilir.
D- ‹fllemin Uygulanmas›
•
Oda ›s›s›nda saklanan boyalar kullan›lmadan önce mutlaka iyice çalkalanmal›d›r.
•
Haz›rlanan lamlar alevde fiske edilir. (Resim 1)
•
Haz›rlanan lamlar›n üzerine AR boyas› dökülür ve 15-20 dakika oda ›s›s›nda
beklenir. Boya lam›n üzerini tamamen kaplamal› ve eksilmemelidir (Resim 2,3).
•
Distile su ile y›kan›r. Klorsuz su kullan›lmal›d›r, çünkü klor floresan› azalt›r
(Resim 4).
•
Y›kama sonras› % 0,5 asit alkol dökülerek 2–3 dakika beklenir. Yeterli
dekolarizasyon iflleminde ç›plak gözle boya görülmez(Resim 5–7).
•
Y›kama ifllemi tekrarlan›r (Resim 8).
•
Zemin boyas› olarak haz›rlanm›fl KMnO4 ile 2 dakika boyan›r. Süre uzat›l›rsa
floresan azalabilir (Resim 9).
•
Y›kan›r ve havada kurutulur (Resim 10).
•
Pozitif bir yaymada mikobakteriler, karanl›k bir zeminde sar›-turuncu parlak,
ince, k›vr›k içi tanecikli floresan veren bakteriler olarak görülür (Resim 11)
•
Her örne¤in boyanmas› s›ras›nda, mutlaka pozitif ve negatif kontrol
kullan›lmal›d›r.
36
•
Boyanan preparatlar en k›sa sürede 25x ya da 40x büyütme ile floresan
mikroskobunda incelenmelidir. Basil morfolojisi x1,000 ya da x450 büyütme ile
kontrol edilmelidir.
•
Gerekirse pozitif de¤erlendirilen preparatlar, EZN ya da Kinyon boya ile
boyanabilir.
E. SONUÇLARIN B‹LD‹R‹M‹:
Negatif: Floresan görülmeyen tüm yaymalar “ Aside dirençli basil görülmedi ‘’
fleklinde raporlan›r.
Pozitif: Karanl›k bir zeminde sar›-turuncu parlak, ince, k›vr›k içi tanecikli floresan
veren bakteriler olarak görülür “Aside dirençli basil görüldü’’ fleklinde rapor
edilir. Boyanma yöntemi belirtilir ve yaymada gözlenen aside dirençli basilin
miktar› hakk›nda bilgi verilir. Basilin miktar› hakk›ndaki de¤erlendirmede karbol
fuksin boyama yönteminde kullan›lan tablo rehber olarak kullan›r.
Resim 1–11: Auramine – Rhodamine Floresan Boyama iflleminin resimlerle izlemi
1
2
3
4
38
KAYNAKLAR
1.
Weitzman I. Mycobacteriology and Antimycobacterial Susceptibility Testing.
Isenberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook ASM Press, Washington
DC, 2004; 7.2.1- 7.3.1.
2. Bilgehan H. Klinik Mikrobiyolojik Tan›. ‹kinci bas›m Bar›fl yay›nlar›. ‹zmir 1995
: 83-84.
3. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC. Color
Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. Fifth edition Lippincott,
Philadelphia.1997: 903 – 905.
4. Uzun M. Tüberküloz tan›s›nda Ehrl›ch-Ziehl-Neelsen, Fluorokrom boyama
yöntemleri ile BACTEC ve Löwenstein-jensen Kültür yöntemlerinin sonuçlar›n›n
d e ¤ er l e n d i r i l m e si Do k t o r a te z i . ‹ s t an b u l T › p F a k ü l t e si . 1 99 4 .
5.
Baron JB, Peterson LR,Finegold SM. Bailey Scott’s Diagnostic Microbiology
9th edition. Mosby-Y ear Book, St Louis, Missouri. 1995:605-608.
6. Nolte FS, Metchock B. Mycobacterium. In: Murray PR, Baron EJ,Pfaller MA,
Tenover FC, Yolken RH eds. Manuel of Clinical Microbiology 6th ed. Washington.
ASM Press. 1995: 400-38.
7. h t t p : / / w w w 2 . p ro v l a b . a b . c a / b u g s / m y c o b / a f b _ s t a i n / z n s t a i n . h t m
Dostları ilə paylaş: |