Hematolojide temel laboratuvar tani yöntemleri Dr. Mutlu Arat

HEMATOLOJİDE TEMEL LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ

• Dr. Mutlu Arat

• AÜTF Hematoloji BD

• [e-mail]

HASTAYA YAKLAŞIM

• Anamnez

• Fizik inceleme

• Öz geçmiş

• Soy geçmiş

• Sistem Sorgusu

• Pozitif Bulgular/Değerlendirme/Ön Tanı

• Tetkik ve Tedavi Planı

• Laboratuvar incelemeler

• Tanıya yönelik invaziv girişimler

LABORATUVAR İNCELEMELER

• Tam kan sayımı

• Retikülosit sayımı

• Sedimentasyon

• EPO

• Temel Koagülasyon testleri

• Serum Demir Profili/Ferritin, FA, Vit B12, Homosistein

• Protein EF /Hb EF

• Immunelektroforez

• Trombosit Fonks. Testleri

Hemoglobin Ölçümü

• Hemoglobin potasyum ferrisiyanür “Drabkin Solüsyonu” ile siyanmethemoglobine dönüştürülmekte ve hemoglobin yoğunluğu, 540 nm.deki adsorbansın spektrofotometrik olarak ölçülmesi ile hesaplanır

• Htk optik sistemle direkt olarak hesaplanabilirken, elektrik empedans yönteminde indirekt olarak KKS ve KK hacmi üzerinden hesaplanmaktadır.

Hemoglobin Ölçümü

Analiz Yöntemleri (1)

• Empedans yöntemi: Hücreler dar bir aralıktan geçerlerken doğru akımda meydana getirdikleri empedans (elektrik direnci) değişimi ile sayı ve büyüklükleri belirlenir. Voltaj değişiklikleri hücre büyüklüğü ile doğru orantılıdır.

Bir Kırmızı Kürenin İlerleyişi

Trombositlerin Kırmızı Kürelerin Arasından Seçilmesi

Analiz Yöntemleri (2)

• Optik sistem: Hücrelerin üzerine gelen lazer ışını değişik yönlere yansır. Dar açı ile meydana gelen yansımalar hücre büyüklüğü, geniş açı ile ortaya çıkanlar ise hücre yapısının (granularite ve çekirdek yapısı) belirlenmesinde kullanılırlar.

Optik Sistem

Hücre Büyüklüğüne Göre Sinyal Oluşumu

Hücreleri Büyüklüklerine Göre Tanımlanma Eşikleri

Lökosit Formülü

Çalışma Basamakları

• Kan örneğini özel antikoagülanlı tüpden aspire edilir

• Bir kısmındaki kan lizise uğratılır Hgb ve BK analizi yapılır.

• Kalan kısım ise hemolize uğratılmadan kırmızı küre ve trombosit analizi için kullanılır.

Analiz Öncesi Dönem

• Kanın alınmasındaki hastanın fizyolojik durumundan alınan kan örneğinin laboratuvara ulaşıp OTKSC’de analiz edilinceye kadar geçen dönemi içine almaktadır.

• Fizyolojik (yaş, yükseklik, gebelik, sigara)

• Örnek alınması (bekleme süresi, antikoagülanların etkileri ve endojen interferans)

• EDTA’ya bağlı psödotrombositopeni

• Trombosit satellitizmi

EDTA’ya Bağlı Trombosit Kümelenmesi (Yalancı Trombositopeni)

Trombosit Satellitizmi (Yalancı Trombositopeni)

Soğuk Antikor Varlığı

Krmızı Küre Histogramı

Kırmızı Küre İndekslerinin Hesaplanması

• OEHB (MCH): [Hgb (g/L) / KKS (10e12/L)]X10

• OEHY (MCHC): [Hgb (g/L) X100 ]/ Htk (%)

• Htk: [OEH (MCV, fL) X KKS (10e12/L)]/10

İndekslerin Alt ve Üst Sınırları

İndekslerin Yorumlanması

• OEH (MCV) klinik ve tanısal yararı en fazla olan eritrosit indeksidir.

• OEHB (MCH) genelde OEH (MCV) ile paralellik gösterir ve klinik yararı kısıtlıdır.

• OEHY (MCHC) demir eksikliği anemisinde diğer mikrositer anemilere göre daha sık olarak düşük bulunmaktadır fakat bu değişiklik geç dönemlerde ortaya çıkar.

• Artmış OEHY sıklıkla herediter siferositozda gözlenir.

Herediter Siferositoz

Kırmızı Küre Dağılım Genişliği I (RDW)

• KKDG aslında KK hacim dağılımının varyasyon katsayısıdır (CV)

• {[Standart Sapma]/ MCH (MCV)}x100

• Her cihazın farklı üst sınır değerleri olmasına rağmen % 14’ün üzerinde olması patolojik olarak kabul edilmektedir.

• “Anisositoz” konusunda bilgi vermekte ve periferik yaymanın mikroskobik incelemesi dahi KK’lerin anormal alt gruplarının saptanmasında KKDG kadar bilgi verici olamamaktadır.

Kırmızı Küre Dağılım Genişliği II (RDW)

• Bu parametrenin artışının, nütrisyonel eksikliklere bağlı gelişen anemilerde ve özellikle de demir eksikliği anemisinde ilk bulgu !! olduğuna dair yayınlar vardır.

• Talasemi taşıyıcılığı ile demir eksikliği anemisi ayırıcı tanısında kullanılmaktadır

OEH ve KGDG Beraber Kullanılması

Kırmızı Küre Olgunlaşması

Retikülosit Sayımı (1)

• OTKSC’lerinde metilen mavisi veya flöresan RNA bağlayıcı boyalarla retikülosit sayısının mutlak değeri saptanabilmektedir

• Manuel yöntemin yetersiz kaldığı düşük-normal retikülosit değerleri belirlenebilmektedir.

• “Mutlak retikülosit sayısı” (=%retikülosit x KKS) eldesi, düzeltilmiş retikülosit yüzdesi (= %Ret x Htk / 45) kavramına gereksinimi ortadan kaldırmaktadır.

Retikülosit Sayımı

Retikülosit Sayımı (2)

• Retikülosit <80x10e9/L rejeneratif olmayan anemi

• Retikülosit >120x10e9/L rejeneratif anemi

• 80x10e9/L < Retikülosit Sayısı <120x10e9/L= gri zon

Retikülosit Sayımı (3)

Normokrom Normositer Anemi

Normokrom Normositer Anemi

Demir Eksikliği Anemisi

55 yaşında kadın hasta artan yorulma nedeniyle doktoruna başvuruyor. Pansitopeni belirlenip hastaneye sevk ediliyor.

Trombosit sayısı ve indeksleri

• Hacimleri 7,8-11 fL

• Sayım 150-450.000/mL

• Psödotrombositopeni: EDTA, paraproteinemi, trombosit satalletizim, uzun süre bekletilmiş kan

PERİFERİK YAYMA

• Wright veya Giemsa boyası kullanılır.

• Kanın tüm şekilli elemanlarının morfolojisini görmekteyiz.

• 10x 10/40 ve 100 büyütmeler ile mikroskopik değerlendirme yapılır.

Sedimentasyon

• Endikasyonlar:

• Hematolojik Malinitelerde tanı/tedavi/prognoz (Malin L, MM, vb)
• Sistemik infeksiyonlar (Öz. Tbc)
• Otoimmun hastalıklarda hastalık aktivitesi

• Sodyum sitratlı kan örneğinde çalışılır (siyah kapaklı,uzun tüpler)

• Kan /Antikoagülan oranı önemli (1/4)

• Kanlar bekletilmemeli

• Ölçüm sırasında ısı, titreşim gibi dış faktörler hata kaynağıdır, ölçümler laboratuvar ortamında yapılmalıdır

Eritropoetin (EPO)

• Endikasyonlar:

• Kronik hastalık anemisi (Inflamasyona sekonder anemiler, anemi ile giden hematolojik maliniteler
• Renal parankimal bozukluğu olanlar
• Eritrositoz ve Polistemiler (Primer/Sekonder)

• ELISA yöntemi kullanılarak ölçülür

• Antikoagulansız kan kullanılır

Koagülasyon Testleri

• Kanama zamanı

• Pıhtılaşma zamanı

• Protrombin zamanı

• İnr (Uluslararası normalizasyon oranı)

• Parsiyel tromboplastin zamanı

• Trombin zamanı

• Fibrinogen/ D-Dimer

Kanama Zamanı

• Kanama zamanı: <10 dakika

• Duke metodu

• Ivy metodu

• Modifiye Ivy: Simplate veya Template 5mm uzunluk ve 1mm derinlikte standart ve yüzeyel kesi yapılır.

Protrombin Zamanı-PTZ

• Ekstrensek yol göstergesidir. Doku faktörü, FVII, FX, FV, FII, I’i gösterir. Oral antikoagulanların etkinliğini izlemede kullanılır.

• 10-14sn

• INR:

• Hasta PZ/Kontrol PZ= 0,8-1,0

Aktive Parsiyel Tromboplastin Zamanı (aPTT)

• İntrensek yolu gösterir.

• FVIII, FIX, FXII eksikliğinde yararlı

• 20-35saniye

Dilüsyon Testi (50:50)

• PTZ uzaması her zaman faktör eksikliğini göstermez.

• Dilusyon testi: Hasta plazması ile normal plazma 1:1 dilue edilir. Bir saat 37 derecede enkübe edilir ve PTZ testi tekrarlanır.

• Yorum:

• PTZ normale dönerse (veya %25 kısalma var): Faktör eksikliği
• PTZ normale dönmedi: Faktörlere karşı inhibitör var.

Serum Demir

• Serum demir düzeyi diurnal varyasyon gösterir ve en yüksek düzeylerine sabah ulaşır.

• Serum demiri kolorimetrik veya RIA ile sabah açlık kanında ölçülür.

• Multivitamin preparatları 24 saat içinde serum demirini yalancı olarak yükseltir.

• Serum demiri, transfüzyon ile de yükseldiğinden multitransfüze hastalarda serum demiri düzeyi yanıltıcı olabilir.

• Serum hemolizli olmamalıdır ve kan silikonize ya da propilen tüplere alınmalıdır.

Demir Bağlama Kapasitesi

• TDBK, demir eksikliği anemisi için en çok spesifik olandır (%100), fakat sensitivitesi düşüktür (%30).

Demir eksikliğinde transferrin artar, demir yüklenmesinde azalır.

• Demir eksikliğinde transferrin artar, demir yüklenmesinde azalır.

• Ayrıca transferrin negatif akut faz reaktanı olup inflamasyon, infeksiyon, malignansi, kronik karaciğer hastalığı ve nefrotik sendromda düzeyi azalır.

• Gebelik ve oral kontraseptif kullanımında ise transferrin düzeyi yalancı olarak artar.

• Steroid alanlarda ise yalancı olarak düzeyi düşer.

Demirin depo formunun solubl şeklidir, depo demiri ile serum ferritini arasında lineer korelasyon vardır.

• Demirin depo formunun solubl şeklidir, depo demiri ile serum ferritini arasında lineer korelasyon vardır.

• Serum ferritini RIA, EIA yöntemleri ile güvenilir olarak ölçülür ve serum ferritin düzeyinin 12 ng/ml'den düşük olması demir depolarının boş olduğunu gösterir.

• Ferritin'in demir eksikliğinde düzeyi azalır, kronik hastalık anemisinde ise artar.

• 1 ng/ml ferritin, 8 ng depo demirine eş değerdir.

• Serum ferritin düzeyi iki haftadan fazla demir tedavisi alınca ya da kan transfüzyonu sonrası bakılırsa yalancı olarak normal ya da yüksek çıkabilir.

• Serum ferritin düzeyine demir tedavisine başlamadan ya da demir tedavisi kesildikten en az bir hafta sonra bakılmalıdır.

• Ferritin bir akut faz reaktanıdır ve inflamasyon, infeksiyon, uzun süreli açlık, KBY, hematolojik malignansi varlığında düzeyi artar ve mevcut olan demir eksikliğini maskeler. Bu tip durumlarda serum ferritin <100 ng/ml olsa dahi demir eksikliğini gösterebilmektedir.

Spesifik Laboratuvar Testleri

• Protein elektroforezi

• İmmun elektroforez

• Hemoglobin elektroforezi

• Trombosit fonksiyon testleri

Protein Elektroforezi

• Endikasyonlar:

• Açıklanamayan Sed. Yüksekliği
• Paraproteinemi varlığı
• Plazma hücre diskrazileri

• Serumda proteinler elektriki mobilitelerine göre incelenmesidir.

• Albumin, alfa1, alfa2, beta, gama

• Immunoglobulinler gama, alfa2 ve beta

Malin veya kontrolsüz üretim

• Malin veya kontrolsüz üretim

• Multiple Miyeloma
• WMG
• Malin lenfoma
• KLL
• Primer Amiloidoz
• Plazma hücreli lösemi
• Ağır zincir hastalığı

• Benin veya stabil üretim

• Benin monoklonal GP
• Soliter plazmasitoma
• Kronik soğuk agll hast.
• Gecici tipte (infeksiyonlara sekonder)
• AIDS
• Gaucher hast.

Hemoglobin Elektroforezi

• Endikasyonlar:

• Hb zinciri sentez bozuklukları: Talassemi sendr.
• Hemoglobinopatiler: Orak hücreli Anemi

Trombosit Fonksiyon Testleri (Agregasyon)

İnvaziv girişimler

• Kemik iliği aspirasyon ve biyopsi

Kemik iliği aspirasyon ve biyopsisi

• Hematolojik ve hematolojik olmayan hastalıkların tanısı ve ayırıcı tanısında kullanılır.

• Her iki iliak krest (posterior veya anterior), sternum, çocuklarda anterior tibia.

KEMİK İLİĞİ ASPİRASYON İĞNESİ

Kemik İliği Aspirasyonu

Boyama Yöntemleri

• Lökosit alkalen fosfataz (LAP)

• PAS

• Peroksidaz

• Sudan-Black

• Esteraz

• Retikülin boyası

• Demir boyası

İleri LaboratuvarYöntemleri

• Akım sitometri

• Konvansiyonel sitogenetik

• PCR

• Flouresan insitu hibridizasyon

• Kimerizm analizi

• HLA Doku tiplendirilmesi

Moleküler Yöntemler

Sonuç

• Laboratuvar yöntemlerin başvurmadan önce;

• Ön tanı nedir?
• Ne bekliyorum?
• Sonuç N üstü veya altı gelirse planım var mı?
• Tedavi yöntemimi değiştirecek mi?
• Doğru yöntem ve doğru zamanlama, uygun kan alma ve yollama
• Laboratuvar hatası var mı?

• İlginiz için teşekkür ederim,

• laboratuvarda görüşmek üzere.

• Dr. M. Arat

• [e-mail]