Endemik Verbascum alyssifolium’da issr-pcr optimizasyonu

Endemik Verbascum alyssifolium’da ISSR-PCR Optimizasyonu

Muhip Hilooğlu¹, Emel Sözen¹, Ali Kandemir<sup>2

1</sup>Anadolu Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü, 26470, Eskişehir

²Erzincan Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, 24100, Erzincan

e-mail: [e-mail]

Giriş

Verbascum alyssifolium Boiss (Scrophulariaceae), Erzincan yöresinde dar yayılış alanına sahip endemik bitki türlerindendir. Bilinen 3 farklı lokalitesi bulunmaktadır. Tür, Türkiye Bitkileri Kırmızı Kitabında Veri Yetersiz (DD) olarak kaydedilmiştir. Bu türe dair morfolojik ve anatomik özelliklerin belirlenmesi dışında bugüne kadar yapılmış herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Popülasyonların değişen çevre şartlarında varlıklarını sürdürebilmeleri tamamen sahip oldukları genetik çeşitliliğe bağlıdır. Nadir ve tehlike altındaki türler için koruma stratejilerinin geliştirilmesinde türlerin genetik çeşitlilik değerlerinin saptanması bu nedenle oldukça önemlidir. Bu çalışma kapsamında Verbascum alyssifolium’a ait DNA örnekleri ile ISSR-PCR optimizasyonu yapılarak türün genetik çeşitlilik seviyelerini belirlemek için kullanılacak olası ISSR primerlerinin saptanması amaçlanmıştır.

Gereçler ve Yöntem

Bitki örneklerine ait DNA’nın izolasyonu için 2XCTAB yöntemi kullanıldı. Bitki örneklerinden elde edilen DNA’ların miktar ve saflık dereceleri Nanodrop Spektrofotometre cihazında 260/280 nm dalga boylarında okunarak tespit edildi. Ayrıca DNA örneklerinin kalitesi ve genomik DNA bantı oluşum durumları %0,8’lik agaroz jelde yürütülerek de belirlendi. PCR için her populasyonu temsilen 1 birey seçilmiş ve bu bireyler ile PCR kurulmuştur. PCR optimizasyonu sırasında sıcaklık, MgCl₂, primer ve kalıp DNA'nın farklı miktarları denenmiş ve en uygun koşullar bulunmaya çalışılmıştır. MgCl₂ için 1-3 µl, kalıp DNA için ve 1-5 µl (2-10 ng), dNTP için 1-4 µl ve 2,5mM’lık ISSR primerleri için de 1-4 µl arasında değerler denenmiştir. PCR prosedürü; 94 °C’de 4 dk. 1 döngü ön denatürasyon, 45 döngü 94 °C’de 45 sn. denatürasyon, 40-64 °C’de 45 sn. primer bağlanma, 72 °C’de 90 sn. uzama, 72 °C’de 7 dk. 1 döngü son uzama ve 4 °C’de bekleme basamaklarından oluşmaktadır. PCR ürünleri yatay jel elektroforezi (Thermo, Midicell Promo) ile %1.4'lik agaroz jel üzerinde 90V'ta 80dk yürütülmüştür ve dijital olarak görüntülenmiştir. Bant büyüklüklerinin belirlenmesi amacıyla 100 bp plus'lık DNA ladder (Fermentas) kullanılmıştır.

Bulgular

DNA izolasyonu sonucu türün 3 populasyonunu temsilen seçilen bireylerden elde edilen DNA miktarları sırasıyla μl’de 112-134-76 ng’dır. Çalışmada toplam 44 ISSR primeri denenmiş, kalıp DNA, MgCl₂ ve dNTP optimizasyonu sonrasında her iki türde de polimorfik ve tekrarlanabilir bantlar oluşturan 20 primer saptanmıştır. Bunlar; GAG(CAA)₅, (CAG)_5, VHV(GT)₇G, (GA)₈YC, (AG)₈G, (GA)₈T, (AC)₈YT, (AG)₈T, (AG)₈C ,(AC)₈C ,(AC)₈G, DD(CGA)₅ ,(AG)₈YT, (GA)₈C, (GGGTG)₃, (TC)₈C, (TC)₈G, (CA)₈RC, (AGT)₆, (CCG)₆ primerleridir. Bu primerler için optimize edilen kalıp, MgCl₂ ve dNTP konsantrasyonları sırasıyla 10ng, 2mM ve 2,5 µM olarak bulunmuştur.

Sonuç ve Tartışma

Yapılan deneyler sonucunda Verbascum alyssifolium türü için denenen 44 adet ISSR primerinden 20 tanesinin kaliteli ve tekrarlanabilir bant verdiği, diğer primerlerin ise iyi çalışmadığı, polimorfik bantlar üretmediği ve genetik çeşitlilik seviyelerinin belirlenmesinde kullanılmayacağı gözlemlenmiştir. Bu çalışma sonucunda elde edilen PCR optimizasyon sonuçları ve belirlenen primerler, Verbascum alyssifolium’un genetik çeşitlilik seviyesinin belirlenmesine yönelik çalışmalarda yol gösterici olacaktır.

Anahtar Kelimeler: Verbascum alyssifolium, Endemik, Genetik çeşitlilik, ISSR-PCR optimizasyonu

Teşekkür

Bu çalışma Anadolu Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu Başkanlığı tarafından (Proje No: 1409F389) desteklenmiştir.