Az élőlényekben, illetve azok egyetlen sejtjében
Yüklə 197,4 Kb. Pdf görüntüsü
|
7 A DNS-chip nagyszámú gén expressziós mintázatának egyidejű meghatározására szolgál. Egyetlen chip 6-10000 gén szimultán vizsgálatát teszi lehetővé. Működésük alapja a DNS-DNS vagy DNS-RNS hibridizáció. A DNS-chip-ek a próbák minősége
segitsegevel, in vitro előallitva; (2) oligonukleotid chipek (20-25 bp) FAKULTATÍV ANYAG A DNS-CHIP KÉSZÍTÉS I: FOTOLITOGRÁFIA (IN SITU , azaz helyben szintetizált chip): ún. fotolitográfiai módszerrel szintetizálják a próbákat a hordozó felszínére. E módszer egy magyar származású kutató, Steven Fodor ötlete. A módszer elve az, hogy az üres lapocskát fényre bomló anyaggal borítják, majd egy olyan maszkkal fedik le, amely miniatűr (< 1 mikron) átmérőjű, bizonyos pontokon perforált kis lyukak ezreit tartalmazza, előre megtervezett eloszlásban. Ha ezt követően fénnyel világítják meg a maszkkal fedett lapocskát, csak ott jön le a fotolabilis anyag, ahol a kis lyukak helyezkedtek el. Ezzel egyidejűleg az egyik a fotolabilis molekulával kapcsolt nukleotidot (pl. A) hozzáadják a rendszerhez, amely így kapcsolódni képes a fény által szabaddá tett pozícióhoz. Ugyanezt három másik, más perforációs mintázatot hordozó maszkkal (C, T, G) megismételve a teljes lapocska fedve lesz kötött nukleotidokkal. Minthogy a nukleotidok fotolabilis anyagot hordoznak, további négy maszk egymásutáni adásával, megvilágítással és a megfelelő nukleotid adagolásával felépíthető a második, harmadik, stb. "emelet", Tehát, például egy 10 "emeletes" oligonukleotid 10 x 4=40 maszkot, negyven megvilágítást és minden negyedik ciklusban ugyanazzal a nukleotiddal való inkubációt jelenti. Ez nem több mint ciklusonként egy perc, tehát példánkban 40 perc alatt készül el egy gén-chip. Minthogy a maszkok perforáltsági mintázatát a számítógép tervezi, az tudni fogja, hogy mely pozíción milyen "emeletek" következtek egymás után tehát az in situ szintetizált oligonukleotid szál sorrendjét. Így már az is érthető, hogy a leolvasáskor (lásd előző rész) az egyes pontok pozitivitása milyen génnek, mely génszakasznak felelt meg. Az előállítás tehát úgy történik, hogy a gyártó betáplálja azokat a génsorrendeket a számítógépbe, amelyekre kíváncsi (pl. vírusok egyedi génjeit, tumort okozó mutációkat, hisztokompatibilitási HLA-molekulák jellegzetes szakaszait, stb.) A számítógép ezek alapján megtervezi a maszkok perforáltságát, sorrendjét és egy automata szintetizátor létrehozza a gén-chipet. Már ma is egy-egy gén-chip előállítása igen olcsó és a kereskedelmi ár sem haladja meg a 100 USD-t. A DNS-CHIP KÉSZÍTÉS II: „NYOMTATÁS”: egy kis lapocskára, szilárd hordozó felületre (lehet üveg, speciális műanyag) robot segítségével (spotted microarray) DNS-próbát visznek fel, akár 1 000 000 DNS-szálat. Ismert e DNS próbák szekvenciája (nukleotidsorrendje) és helyzete is. Ez úgy lehetséges, hogy a számítógép "megjegyzi", hogy a kétdimenziós rácson melyik pozícióban, milyen nukleotidszerkezet található. A DNS kovalensen köt a hordozóhoz. Ezt követően ehhez a chiphez adják hozzá az in situ hibridizációhoz hasonló módon egy oldatban a vizsgálandó személy (organizmus) sejtjeiből izolált DNS- (illetve RNS-) darabokat (esetleg ezek polimeráz láncreakcióval (PCR) felszaporított tömegét), melyet előzőleg fluoreszcens festékkel megjelöltek. Rövid inkubálás után kimossák a nem kapcsolódó nukleinsavdarabokat. Könnyen belátható, hogy a megfelelő színes nukleinsavdarabok csak oda kapcsolódnak, ahol az előbb említett nukleotidbázis komplementaritás teljesül. Más szóval, úgy történik meg az inkubálás majd a mosás, hogy csak azok a szálak kössék meg a nekik megfelelő jelzett nukleinsavdarabokat, ahol teljes a sorrend azonossága. Ezt követően egy "scanning" rendszer leolvassa a színes és sötét pontokból álló mintázatot és már csak az eredmények értékelése van hátra. Itt újra a számítógépé a főszerep, hiszen az "tudja", hogy mely pozícióban milyen génszakasz található. Ha például az egyik rácsponton a HIV jellegzetes génszakaszát helyezték el, és ott pozitív reakciót jelez a leolvasó, ez azt jelenti, hogy a beteg mintájában előfordult ez a vírus. 8 HASZNÁLATA különböző mintákból a génexpressziók összehasonlítására: Több szín, fluoreszcens festék alkalmazása lehetővé teszi, hogy ugyanazon fajta chip-ből az egyiket egy kezelt pl. piros festékkel jelzett, a másikat pedig egy kezeletlen minta zöld festékkel jelölt DNS-mintájával inkubálják Ebben az esetben a két mintából származó RNS-t reverz transzkripcióval cDNS-sé írunk át. A cDNS-t felépítő nukleotidokat fluoreszcensen jelöljük: a két RNS populáció átírására szolgáló nukleotidok jelöléséhez tehát két, spektrális tulajdonságaiban egymástól különböző festéket használunk (a példában a kontroll mintából származó RNS-ek átírásához zöld Cy3 festékkel jelölt nukleotidokat használunk, míg a kezelt esetben piros Cy5 festéket) pirosan és zölden fluoreszkáló cDNS-eket kapunk, amelyeket egy DNS-chipen hibridizálva, majd egy nagyfelbontású lézerszkenneres leolvasás után meghatározhatjuk az egyes gének relatív kifejeződése. A gén aktivitása az adott pontban detektálható fluoreszcens jel intenzitásával arányos. Ha egy pontban a kezelt mintából származó fluoreszcens jel erősebb, az azt jelenti, hogy a kezelés hatására az adott gén aktivitása megemelkedett.
bonyolult programokkal és igen fejlett számítógépes technikával történik. A számítógép a leolvasás után egymásra képes vetíteni a leolvasott mintázatokat. Ott, ahol mindkét esetben (kezelt-kezeletlen, vagy beteg-egészséges, stb.) azonos a gén (illetve az ennek megfelelő DNS-darab) szerkezete, a zöld és a piros egymásra vetülve sárga színt ad. Ahol hiányzik a kezelt mintából a megfelelő DNS-szakasz, a zöld szín jelenik meg, ahol csak a kezeltben van valamely DNS-szerkezet, ott a piros szín dominál. Így, mintegy kivonható egymásból a két eredmény és a különbségre génszinten derül fény. Az eljárással képet kaphatunk egyes gének föl-, illetve alulexpresszálódásáról. Egyes daganatokban expresszálódó gének, az ún. génmintázat, a normálissal, illetve különböző daganattípusok egymással hasonlíthatók össze. Ennek eredményeképpen a daganatok a génexpressziós profil alapján egymástól elkülöníthetők. A DNS CHIPEK FELHASZNÁLÁSA: (1) Fertőzések felismerése, mikroorganizmusok azonosítása. (2)Rákdiagnosztika: diffúz nagy B-sejtes limfóma (DLBLC) típusok megkülönbözetése alkalmas kezelés. (3) SNP-kdetektálása. (4) miRNS-microarray–különböző ráktípusokban megfigyelhető, hogy bizonyos miRNS- ekalul/túlexpresszálódnak FERTŐZÉSEK DETEKTÁLÁSA: a jelenleg ismert genomú
mikroorganizmusok: vírusok, baktériumok, gombák teljes, specifikus génszekvenciája felvihető a chipekre, s így pl. néhány csepp vérből kimutatható, hogy a vér „tulajdonosa” mivel fertőzött. Nemcsak maga a mikroorganizmus, de a terápiás megoldás is megközelíthető (pl. antibiotikum-rezisztencia spektrum) ezzel a módszerrel. Már jelenleg is rendelkezésre áll a kereskedelmi forgalomban az a chip, amely a HIV-ellenes szerekkel szembeni rezisztenciát mutatja ki. EXTRA KÖVETELMÉNY DIAGNOSZTIKA: a microarray a betegségek diagnosztizálásának jövőbeli fontos eszköze??? Egy amerikai kutatócsoport (Pat Brown & David Botstein csoportja) és jó néhány más kutatóintézet kapcsolatot épített ki egymással annak érdekében, hogy a DNS chipeket a diffúz nagy B-sejtes limfóma (DLBCL) diagnosztizálására alkalmassá tegyék. A DLBLC a B-sejtek rendkívül agresszív, rosszindulatú elváltozása. Az USA-ban évente kb. 25 000 új esetet jelentenek. A DLBLC diagnózisa morfológiai és molekuláris jellegzetességek kombinációján alapul. Kemoterápiával a betegek
Yüklə 197,4 Kb. Dostları ilə paylaş:
|